Изоляция Брюшина производные тучных клеток и их функциональные характеристики с Ca^{2 +}-изображений и дегрануляции анализов

МКН играть заметную роль во время врожденного и приобретенного иммунного ответа. В частности MCs участвовать в убийстве патогенов, таких как бактерии и паразиты и также ухудшить потенциально токсичных эндогенного пептидов или компоненты яды (для обзора см. Галли et al. 2008¹). Физиологическая роль МКН в врожденная и адаптивного иммунитета является предметом оживленных дискуссий. Таким образом многочисленные расхождения данных в исследованиях, выполненных с различными моделями мышь MC-недостаточным требует систематической переоценки иммунологической функции помимо специальные²МКН. Зрелые MCs преимущественно локализуются в ткани и органы, такие, как кожи, легких и кишечника и обычно находятся только в небольших количествах в крови. MCs являются производными от кроветворных прекурсоров, таких как MC прародителями и завершить их дифференцировки и созревания в микросреды почти все васкуляризированной тканей¹. Т-клеток, полученных фактор интерлейкина (IL) -3 выборочно способствует жизнеспособности, пролиферации и дифференцирования плюрипотентных населения мыши MCs от их гемопоэтических прародителями³. Стволовых клеток фактора (SCF) производится структурных клеток в тканях и играет решающую роль в развитии MC, выживания, миграции и функции⁴. Свойства отдельных MCs может отличаться в зависимости от их способность синтезировать и хранить различные протеазы или протеогликанов. В мышей так называемой соединительной ткани тип MCs отличаются от слизистой MCs согласно анатомической локализации, морфология и содержание гепарина и протеаз⁵.

В MCs, увеличение свободной цитозольной Ca^{2 +} ([Ca^{2 +}]_я) является необходимым для дегрануляция и производства эйкозаноидов, а также для синтеза цитокинов и активация факторов транскрипции в ответ на антиген и различные secretagogues⁶. Главная задача течению этих стимулов — фосфолипаза C, который гидролизует фосфатидилинозитол 4,5-Бисфосфат диацилглицерол (DAG) и инозитол 1,4,5-trisphosphate. Даг активирует Протеинкиназа С и IP3 освобождает ионы Ca^{2 +} от эндоплазматического ретикулума. Истощение этих магазинов активирует Ca^{2 +} приток через плазматическую мембрану Ca^{2 +} каналы, ведущие к хранить запись оперированных кальция (SOCE). Этот процесс вызвал путем взаимодействия Ca^{2 +}-датчик, стромы взаимодействия молекулы-1 (Stim1), в эндоплазматический ретикулум с Orai1⁷ , а также через активацию Переходный рецепторный потенциал канонические (Термизатор) канала белки (для обзора см. Freichel и др. 2014⁸) в плазматической мембраны.

Для изучения физиологической роли этих каналов, несколько фармакологических (применение блокаторы кальциевых каналов) или генетические подходы обычно используются. В последнем случае, подавление экспрессии белка достигается путем ориентации мРНК (нокдаун) или геномной ДНК редактирования с глобальной или ткани конкретных⁹ исключить экзона кодирования поры, образуя Субблок канала (нокаут). Наличие окон с достаточной точностью для этих каналов является ограниченной. Кроме того, бросовым подход требует тщательного контроля ее эффективность с помощью, например., Западная пятно анализа и препятствует отсутствие специфических антител для целенаправленных канал протеина во многих случаях. Таким образом использование моделей мышей нокаут до сих пор рассматривается как золотой стандарт для такого анализа. Предпочтительным в vitro модель для исследования функций MC является выращивание ЧВК, которые могут быть изолированы ex vivo как полностью зрелые населения (в отличие от дифференциации МКН в vitro от, например., клетки костного мозга)¹⁰ . По сравнению с MCs костного производных (BMMCs), которые также часто используются для изучения MC функции в пробирке, стимуляция FcεRI и бета hexosaminidase релиз увеличивается спецавтотехнике и 100 раз в компании “ПМКС”, соответственно. В этой статье мы опишем способ изоляции и культивирование мышиных ЧВК, который позволяет получить после 2 недель культивирования большое количество чистого соединительной ткани типа МКН, достаточного для дальнейшего анализа.

Несмотря на недавний прогресс в разработке и применении показателей генетически закодированный кальция их использование по-прежнему ограничивается трудностями в доставке генов в клетки-мишени, конкретно, в весьма специализированных клеток, таких как основной культурный MCs. Кроме того эта группа Люминесцентные индикаторы для [Ca^{2 +}]_я измерений по-прежнему не хватает ratiometric красители с высоким динамическим диапазоном. По этим причинам предпочтительным методом для ratiometric [Ca^{2 +}]_я измерения по-прежнему является использование флуоресцентных красителей «Фура-2»¹¹.

В настоящее время наиболее часто используемый подход для оценки MC активации и дегрануляции измерения β-hexosaminidase деятельности. Β-hexosaminidase, аллергических посредника, является одним из компонентов MC гранул, которые совместно выпущенные с гистамина в постоянной пропорции от MCs¹². Β-hexosaminidase легко и точно измерять через его реакции с конкретного субстрата, который производит измеримые количество colorigenic продукт, который легко обнаружить в Гонав колориметрические assay. Сообщается, что в этой статье, применение этого метода для анализа ЧВК дегрануляции в ответ на различные стимулы.

Агрегирование высокоспецифичные рецепторы плазмалеммарного IgE (FcɛRI) активирует в MCs универсальный внутриклеточных сигнальный путь, приводит к высвобождению содержание секреторных гранул в окружающем пространстве внеклеточного. Помимо специфического антигена, многие другие раздражители могут активировать MCs выпустить разнообразных иммуномодулирующих посредников, таких как дополнение anaphylatoxins (например., C3a и С5а)¹³, эндотелина вазоконстриктора пептид 1 (ЭТ1)¹⁴ , а также многочисленные Катионный вещества и препараты, провоцируя pseudoallergic реакций (например., icatibant)¹⁵ путем привязки к MRGPRX2¹⁶. Внутриклеточных сигнальных путей, участвующих в MRGPR-индуцированной MCs дегрануляции характеризуются плохо по сравнению с FcɛRI опосредованной внутриклеточная сигнализация; Эти пути только начал интенсивно изучаться в течение последних нескольких лет¹⁷ после идентификации рецептор¹⁶. В основном каналы иона плазматической мембраны, участвующих в вход кальция, следуют MRGPRX2 стимуляции по-прежнему следует понимать. Таким образом настоящей статьи также фокусируется на сигнализацию внутриклеточного кальция и дегрануляции MCs стимулировали с агонисты MRGPR.