Isolamento dei mastociti peritoneo-derivati e loro caratterizzazione funzionale con Ca^{2 +}-imaging e degranulazione saggi

MCs gioca un ruolo di primo piano durante la risposta immunitaria innata ed acquisita. In particolare, MCs partecipare l’uccisione degli agenti patogeni, quali batteri e parassiti e anche degradare peptidi endogeni potenzialmente tossici o componenti dei veleni (per vedere la recensione Galli et al. 2008¹). Il ruolo fisiologico di MCs nell’immunità innata e adattiva è oggetto di acceso dibattito. Pertanto, le numerose discrepanze di dati negli studi effettuati con diversi modelli di mouse MC-carenti richiedono una rivalutazione sistematica delle funzioni immunologiche di MCs oltre allergia². MCs maturo sono principalmente localizzati in tessuti e organi come la pelle, del polmone e intestino e solitamente sono trovati soltanto in piccole quantità nel sangue. MCs derivano da precursori ematopoietici, come progenitori MC e completare la loro differenziazione e maturazione nei microambienti di quasi tutti i tessuti vascolarizzati¹. T-cellula-derivati fattore interleuchina (IL) -3 promuove selettivamente la vitalità, la proliferazione e la differenziazione di una popolazione pluripotenti del mouse MCs da loro progenitori ematopoietici³. Fattore della cellula formativa (SCF) è prodotto dalle cellule strutturali nei tessuti e svolge un ruolo cruciale nello sviluppo, sopravvivenza, migrazione e funzione⁴MC. Le proprietà di singoli MCs possono differire a seconda della loro capacità di sintetizzare e memorizzare varie proteasi o proteoglicani. Nei topi, il cosiddetto tessuto connettivo-tipo MCs si distinguono dalle mucose MCs secondo la loro localizzazione anatomica, la morfologia e il contenuto di eparina e proteasi⁵.

Nel MCs, un aumento di libero citosolico Ca^{2 +} ([Ca^{2 +}]_i) è indispensabile per la produzione degli eicosanoidi e degranulazione, così come per la sintesi di citochine e l’attivazione di fattori trascrizionali in risposta all’antigene e diversi secretagoghi⁶. Un importante obiettivo a valle di questi stimoli è fosfolipasi C, che idrolizza il fosfatidilinositolo 4,5-bisfosfato diacilglicerolo (DAG) e inositolo 1,4,5-trifosfato. DAG attiva la proteina chinasi C e IP3 rilascia ioni di Ca^{2 +} dal reticolo endoplasmatico. Lo svuotamento di questi negozi attiva afflusso di Ca^{2 +} attraverso la membrana plasmatica Ca^{2 +} canali, portando a memorizzare voce calcio gestito (SOCE). Questo processo è evocato attraverso l’interazione del Ca^{2 +}-sensore, stromal interazione molecola-1 (Stim1), nel reticolo endoplasmatico con Orai1⁷ , nonché attraverso l’attivazione di recettori transitoria potenziali canonico (TRPC) canale proteine (per review Vedi Freichel et al. 2014⁸) nella membrana plasmatica.

Per studiare il ruolo fisiologico di questi canali, molti farmacologici (applicazione di bloccanti dei canali) o approcci genetici sono tipicamente utilizzati. In quest’ultimo caso, soppressione dell’espressione della proteina è realizzata prendendo di mira il mRNA (atterramento) o la modifica di DNA genomico con globale o tessuto-specifici⁹ omissione di un esone codifica un poro che formano unità secondaria di un canale (knockout). La disponibilità di un bloccante con sufficiente specificità per questi canali è limitata. Inoltre, l’approccio atterramento richiede controllo attento della sua efficacia utilizzando, ad es., Western blot analisi ed è ostacolata dalla mancanza di anticorpi specifici per la proteina canale mirato in molti casi. Così, l’utilizzo di modelli murini knockout è ancora considerato come il gold standard per questo tipo di analisi. Un modello preferito in vitro per lo studio delle funzioni MC è la coltivazione di PMC che può essere isolato ex vivo come una popolazione completamente matura (al contrario di differenziazione MCs in vitro da, ad es., cellule del midollo osseo)¹⁰ . Rispetto al midollo osseo derivato MCs (cellule), che vengono anche comunemente utilizzati per studiare la funzione MC in vitro, la stimolazione di FcεRI e beta-esosaminidasi rilascio è aumentato 8 volte e 100 volte in PMCs, rispettivamente. In questo articolo, descriviamo un metodo di isolamento e coltura di PMCs murino, che permette di ottenere dopo 2 settimane di coltura un numero elevato di puro tessuto connettivo tipo MCs, sufficiente per un’ulteriore analisi.

Nonostante i recenti progressi nello sviluppo e applicazione di indicatori di calcio codificato geneticamente, il loro uso è ancora limitata da difficoltà nella consegna dei geni alle cellule bersaglio, in particolare, in cellule altamente specializzate quali primaria MCs coltivate. Inoltre, questo gruppo di indicatori fluorescenti per [Ca^{2 +}]_io misure manca ancora raziometrici coloranti con un’alta gamma dinamica. Per questi motivi, il metodo preferito per raziometrica [Ca^{2 +}]_ho misura è ancora l’uso del colorante fluorescente “Fura-2”¹¹.

Attualmente, il più diffuso approccio per la valutazione dell’attivazione di MC e degranulazione è la misura dell’attività β-esosaminidasi. Β-esosaminidasi, un mediatore allergico, sono uno dei componenti del granello di MC che è co-pubblicato con istamina in proporzione costante da MCs¹². Β-esosaminidasi possono essere misurata facilmente e con precisione attraverso la reazione con un substrato specifico, che produce una quantità misurabile di un prodotto colorigenic che è facilmente rilevabile in un saggio colorimetrico di micropiastre. In questo articolo, un’applicazione di questa tecnica per l’analisi del degranulation di PMC in risposta a vari stimoli è segnalata.

Aggregazione del recettore IgE plasmalemmal ad alta affinità (FcɛRI) attiva nel MCs una versatile via di segnalazione intracellulare, che conduce ad un rilascio del granello secretivo contenuto nello spazio extracellulare circostante. Oltre l’antigene specifico, molti altri stimoli possono attivare MCs per rilasciare una gamma diversificata di mediatori di immunomodulatori, come complemento anafilotossine (ad es., C3a e C5a)¹³, il vasocostrittore del peptide endotelina 1 (ET1)¹⁴ , così come numerose sostanze cationiche e farmaci provocando reazioni pseudoallergiche (ad es., icatibant)¹⁵ legandosi a MRGPRX2¹⁶. Vie di segnalazione intracellulari coinvolti nella degranulazione MCs indotta da MRGPR sono poco caratterizzate rispetto FcɛRI-mediata segnalazione intracellulare; queste vie solo cominciato a essere studiato intensivamente durante l’ultimo pochi anni¹⁷ dopo l’ identificazione del recettore¹⁶. In gran parte, i canali ionici di membrana plasmatica coinvolti nella voce calcio seguita da stimolazione MRGPRX2 rimangono per essere capito. Pertanto, il presente articolo si concentra anche su segnalazione del calcio intracellulare e degranulazione di MCs stimolate con gli agonisti MRGPR.