Isolatie van mestcellen buikvlies afkomstige en hun functionele karakterisering met Ca^{2 +}-beeldvorming en degranulatie vitrotests

MCs spelen een prominente rol tijdens aangeboren en verworven immuunrespons. Specifiek, MCs deelnemen aan het doden van ziekteverwekkers, zoals bacteriën en parasieten, en ook degraderen potentieel toxische endogene peptiden of componenten van de boosdoeners (voor recensie zie Galli et al. 2008¹). De fysiologische rol van MCs in aangeboren en adaptieve immuniteit is het onderwerp van een verhit debat. Daarom moeten de talrijke verschillen van de gegevens in de studies met verschillende Muismodellen van de MC-deficiënte systematische herbeoordeling van immunologische functies voor MCs buiten allergie². Volwassen MCs zijn meestal gelokaliseerd in weefsels en organen zoals de huid, longen en darmen, en bevinden zich meestal alleen in kleine aantallen in het bloed. MCs hematopoietische precursoren, zoals MC progenitorcellen, ontlenen en hun differentiatie en rijping in de microenvironments van bijna alle gevacuoliseerd weefsels¹te voltooien. Factor T-cell-derived Interleukine (IL) -3 promoot selectief de levensvatbaarheid, proliferatie en differentiatie van de bevolking van een pluripotente van muis MCs uit hun hematopoietische progenitorcellen³. Stamcel factor (SCF) wordt geproduceerd door structurele cellen in de weefsels en speelt een cruciale rol in de MC ontwikkeling, overleving, migratie en functie⁴. De eigenschappen van afzonderlijke MCs kunnen verschillen afhankelijk van hun vermogen om te synthetiseren en slaan verschillende proteasen of proteoglycans. Bij muizen, zijn de zogenaamde bindweefsel-type MCs mucosal MCs volgens hun anatomische lokalisatie, de morfologie en de inhoud van heparine en proteasen⁵onderscheiden.

In MCs, een stijging van gratis cytosolische Ca^{2 +} ([Ca^{2 +}]_ik) is onmisbaar voor de degranulatie en productie van eicosanoiden, alsmede voor de synthese van cytokinen en activering van transcriptiefactoren in reactie op het antigeen en verschillende secretagogues⁶. Een belangrijk downstream doelwit van deze stimuli is phospholipase C, die ontstabiel phosphatidylinositol 4,5-difosfaat tot diacylglycerol (DAG) en inositol-1,4,5-trisphosphate. DAG geactiveerd proteïne kinase C en IP3 releases ionen van Ca^{2 +} van het endoplasmatisch reticulum. Uitputting van deze winkels activeert Ca^{2 +} toestroom via plasmamembraan Ca^{2 +} kanalen, wat leidt tot het opslaan van bediende calcium ingang (SOCE). Dit proces wordt opgeroepen door de interactie van de Ca^{2 +}-sensor, stromale interactie molecuul-1 (Stim1), in het endoplasmatisch reticulum met Orai1⁷ , alsook door middel van de activering van voorbijgaande receptor potentiële canonieke (TRPC) kanaal eiwitten (voor recensie zie Freichel et al. 2014⁸) in het plasma-membraan.

Om te studeren worden de fysiologische rol van deze kanalen, verschillende farmacologische (toepassing van kanaal-blokkers) of genetische benaderingen meestal gebruikt. In het laatste geval, onderdrukking van eiwit expressie wordt bereikt door zich te richten van mRNA (knockdown) of genomic DNA bewerken met globale of weefsel-specifieke⁹ schrapping van een exon codering een porie vormen subeenheid van een kanaal (knock-out). De beschikbaarheid van een blocker met voldoende specificiteit voor deze kanalen is beperkt. Daarnaast de vechtpartij aanpak vereist zorgvuldige controle van haar effectiviteit gebruikt, bijv., westelijke analyse van de vlek, en wordt gehinderd door het ontbreken van specifieke antilichamen voor de gerichte kanaal proteïne in veel gevallen. Dus, het gebruik van knock-out Muismodellen wordt nog steeds beschouwd als de gouden standaard voor een dergelijke analyse. Een voorkeur in vitro model voor het onderzoek van MC functies is de teelt van PMCs die geïsoleerde ex vivo als een volwassen populatie worden kunnen (in tegenstelling tot differentiëren MCs in vitro van, bijv., beenmergcellen)¹⁰ . In vergelijking met het beenmerg afgeleid MCs (BMMCs), die ook gebruikt zijn bij het bestuderen van MC functie in vitro, de stimulatie van FcεRI en bèta-hexosaminidase is versie verhoogd, 8-fold en 100-fold in PMCs, respectievelijk. In dit artikel beschrijven we een methode van isolatie en de teelt van lymfkliertest PMCs, die het mogelijk maakt om te verkrijgen na 2 weken voor het kweken van een groot aantal zuivere bindweefsel Typ MCs, voldoende voor verdere analyse.

Ondanks de recente vooruitgang in de ontwikkeling en toepassing van genetisch gecodeerde calcium indicatoren het gebruik ervan is nog steeds beperkt door moeilijkheden bij de levering van genen aan doelcellen, specifiek, in zeer gespecialiseerde cellen zoals primaire gekweekte MCs. Bovendien ontbreekt deze groep van fluorescerende indicatoren voor [Ca^{2 +}]_ik metingen nog steeds ratiometric kleurstoffen met een hoog dynamisch bereik. Om deze redenen is de aanbevolen methode voor meting van ratiometric [Ca^{2 +}]_ik nog steeds het gebruik van de fluorescente kleurstof “Fura-2”¹¹.

Op dit moment de meest gebruikte aanpak voor de evaluatie van de activering van de MC en degranulatie is het meten van β-hexosaminidase-activiteiten. Β-hexosaminidase, een allergische bemiddelaar, is een van de onderdelen van de MC-submodule die mede vrijgegeven met histamine is in constante verhouding van MCs¹². Β-hexosaminidase kan gemakkelijk en nauwkeurig gemeten worden door de reactie met een specifieke substraat, die produceert een meetbare hoeveelheid een colorigenic product dat gemakkelijk in een microplate colorimetrische bepaling aantoonbaar. In dit artikel, is een toepassing van deze techniek voor de analyse van PMCs degranulatie in reactie op een verscheidenheid van stimuli gemeld.

Samenvoeging van de hoge-affiniteit plasmalemmal IgE-receptor (FcɛRI) wordt geactiveerd in MCs een veelzijdige intracellulaire signalering weg, wat leidt tot een vrijval van secretoire submodule inhoud in de omliggende extracellulaire ruimte. Naast het specifieke antigeen, vele andere stimuli MCs om los van een divers scala aan immunomodulerende bemiddelaars, zoals aanvulling anafylatoxines kunnen activeren (bv., C3a en C5a)¹³, de vasoconstrictor peptide endothelin 1 (ET1)¹⁴ , als ook talrijke kationogene stoffen en drugs veroorzaken pseudoallergic Reacties (bv., icatibant)¹⁵ door binding aan MRGPRX2¹⁶. Intracellulaire signaalroutes die betrokken zijn bij MRGPR-geïnduceerde MCs degranulatie worden slecht gekenmerkt in vergelijking met FcɛRI-gemedieerde intracellulaire signalering; deze trajecten alleen gestart worden intensief bestudeerd tijdens de laatste paar jaar¹⁷ na de receptor identificatie¹⁶. Grotendeels, blijven het plasmamembraan ionenkanalen die betrokken zijn bij de ingang van calcium gevolgd door stimulatie van de MRGPRX2 om te worden begrepen. Dus, dit artikel ook focust op intracellulair calcium signalering en degranulatie van MCs gestimuleerd met MRGPR-agonisten.