腹膜由来マスト細胞とその機能特性と Ca2 +の単離-イメージングと脱顆粒の試金
Summary
ここでは、分離し、マウスの腹腔肥胖細胞を養うプロトコルを提案します。2 つのプロトコルの機能特性評価についても述べる: リリースされた β-ヘキソアミダーゼの比色定量に基づく細胞内 Ca2 +濃度を無料と脱顆粒試験の蛍光イメージング。
Abstract
肥満細胞 (MCs)、免疫システムの一部としていくつかの病原体に対するホストを守るために、アレルギーの免疫応答の開始に重要な役割を再生します。MCs の高親和性 IgE 受容体 (受容) だけでなく、他のいくつかの受容体の刺激による IgE がバインドされた表面のクロスリンクすることにより活性化無料の細胞内 Ca2 +濃度の上昇が開始されます ([Ca2 +]私)アレルギー炎症性メディエーターの放出を促進します。これらのシグナル伝達経路に関与する分子の同定は、MC の機能制御を理解するため重要です。この記事で腹膜 MCs (Pmc) のマウスの結合組織型腹膜灌流による MCs の分離と培養のためのプロトコルについて述べる。この方法による様々 なノックアウト マウス モデルから MCs の文化は、MC シグナル伝達経路に関与するタンパク質の同定に有用なアプローチを表しています。また、Ca2 +シグナル MCs。 蛍光ベース監視の [Ca2 +]私の定量化のための重要な技術は信頼性の高い単一セル Fura 2 するイメージングのためのプロトコルについても説明し、よくするアプローチを使用Ca2 +シグナル イベント、MC の活性化にとって重要であるストア作動性カルシウム エントリを含むを研究します。MC 脱顆粒の解析、β ヘキソアミダーゼ リリース アッセイをについて説明します。MCs β-ヘキソアミダーゼで説明されているすべての 3 つ異なる分泌のサブセットの脱顆粒マーカーはで colorigenic 基板との反応によって容易に定量化ことができますはとしての β-ヘキソアミダーゼの培養液中に放出される量を。マイクロタイター プレートの比色定量法。この再現性の高い技術、コスト効果の高い特殊な装置は必要ありません。指定されたプロトコルが高収率を示します全体的にみて、典型的な MC の表面マーカーを表現する MCs の MCs の典型的な形態および表現型特徴を表示して、Ca2 +– のところ再現性の高いレスポンスを発揮イメージングおよび脱顆粒の試金。
Introduction
MCs は、自然免疫と獲得免疫の間に顕著な役割を果たします。具体的には、MCs は細菌や寄生虫などの病原体の殺害に参加し、潜在的に有毒の内因性ペプチドや毒 (レビュー ガリら20081を参照) のためのコンポーネントも低下します。自然免疫と適応免疫の MCs の生理的役割激論の主題であります。したがって、異なる MC 欠損マウス モデルで実施された試験で多数のデータの不一致アレルギー2MCs の免疫学的機能の体系的な再評価が必要です。成熟した MCs は、大抵集中する組織や皮膚、肺、腸などの臓器で、通常血に小さな数字でのみ発見します。MCs は MC 前駆細胞などの造血前駆細胞に由来し、分化と成熟、微小でほぼすべての血管柄付きの組織1を完了します。T 細胞由来因子インターロイキン (IL)-3 は選択的にその造血前駆細胞3からの生存・増殖・分化多能性人口マウス MCs を促進します。幹細胞因子 (SCF) は、組織の構造細胞によって生成され、MC 開発、生存、移行、および関数4の重要な役割を果たしています。個々 の MCs の特性を合成して様々 なプロテアーゼやプロテオグリカンを格納する能力によって異なります。マウス、いわゆる結合組織型 MCs は解剖学的局在、形態、およびヘパリンおよびプロテアーゼの5の内容に従って粘膜 MCs と区別されます。
MCs の増加は無料のゾル性細胞質 Ca2 + ([Ca2 +]私) が脱顆粒とエイコサノイドの生産のためだけでなく、サイトカインの合成と抗原に対する応答における転写因子の活性化は不可欠ですし、様々 な分泌刺激6。これらの刺激の主要な下流ターゲットはジアシルグリセ ロール (DAG) とイノシトール 1,4,5 三リン酸ホスファチジルイノシトール 4, 5-ビスリン酸を加水分解するホスホリパーゼ C、です。DAG はプロテインキナーゼ C を活性化し、IP3 は、Ca2 +小胞体からのイオンを解放します。これらの店の枯渇は、原形質膜 Ca2 +チャネル作動させたカルシウム エントリ (SOCE) を格納するリードを介する Ca2 +流入をアクティブにします。このプロセスは Ca2 +との相互作用を誘発-センサー、一過性受容体電位標準 (TRPC) チャネルの活性化を介してだけでなく、Orai17と小胞体で間質相互作用分子-1 (Stim1)(レビューを参照してください Freichelらのタンパク質20148) 血しょう膜の。
勉強するには、いくつかの薬理学的これらのチャネルの生理的役割、(チャンネル遮断薬の適用) または遺伝的アプローチは通常使用されます。後者の場合、タンパク質発現の抑制がターゲット mRNA (ノックダウン) によって達成されるゲノム DNA が細孔の形成 (ノックアウト) チャネルのサブユニットをコードするエクソンのグローバルまたは組織固有の9削除と編集。これらのチャンネルに十分な特異的なブロッカーの可用性は制限されています。さらに、ノックダウンの方法は、例を使用して、その有効性の注意深い制御を必要があります。 西部、ブロット分析、および多くの場合対象となるチャネル蛋白質のための特定の抗体の使用不能によって妨げられています。したがって、ノックアウト マウス モデルの使用は、そのような分析のためのゴールド スタンダードとしてみなされます。MC の機能の調査のため最寄りの in vitroモデルは分離前のヴィヴォ完全に成熟した個体としては、Pmc の栽培 (MCs体外、例えばから差別化ではなく、骨髄細胞)10。.MC 関数体外受容と β ヘキソアミダーゼの刺激を研究にも使われている骨髄由来 MCs (BMMCs) に比べてリリース 8 倍と 100 倍に増資 Pmc、それぞれ。この記事では、純粋な結合組織の数が多いを培養 2 週間タイプ MCs、さらなる分析のための十分な後に取得することができますマウス Pmc の培養と分離のメソッドについて説明します。
開発及び遺伝的コード化カルシウム指標の適用の最近の進歩にもかかわらず、使用状況限られている標的細胞に遺伝子の配信の難しさによって具体的には、一次培養 MCs など専門性の高い細胞。さらに、[Ca2 +]私の測定のための蛍光プローブのこのグループには、レシオ メトリック染料と高ダイナミック レンジまだ欠けています。これらの理由から、最寄りレシオ メトリック [Ca2 +]私の測定法はまだ蛍光染料「Fura 2」11の使用です。
現在、MC 活性化の評価のために最も一般的に使用されるアプローチと脱顆粒が β-ヘキソアミダーゼ活性の測定。Β-ヘキソアミダーゼ、アレルギーの調停は、MCs12から一定の割合でヒスタミンが分泌される MC 顆粒コンポーネントの 1 つです。Β-ヘキソアミダーゼは、マイクロ プレートの比色定量法で容易に検出できるが colorigenic 製品の測定可能な量を生成する特定の基質との反応によって容易にかつ正確に測定できます。この資料では、この様々 な刺激への応答で Pmc の脱顆粒の解析手法の応用が報告されます。
高親和性の原形質膜 IgE 受容体 (FcɛRI) の集計は MCs の分泌顆粒周囲の細胞外領域のコンテンツのリリースにつながる多彩な細胞内シグナル伝達経路をアクティブにします。特異抗原に加えて、他の多くの刺激は免疫調節メディエーター、補体によりなどの多様な配列を解放する MCs をアクティブ化できます (e.g、C3a と C5a)13、血管収縮ペプチド エンドセリン 1 (ET1)14。、数々 のカチオン性物質と pseudoallergic 反応の刺激薬として (e.g。、icatibant)15 MRGPRX216へのバインド。MRGPR 誘起 MCs 脱顆粒反応に関与する細胞内シグナル伝達経路の FcɛRI を介した細胞内シグナル伝達; と比較して特徴は不十分これらの経路は、受容体同定16後最後の数年間17の間に集中的に調査される開始。主として、カルシウム項目の後に MRGPRX2 刺激に関与する細胞膜のイオン チャネルは、理解されるに残る。したがって、本稿はまた細胞内カルシウム シグナルに焦点を当て、MRGPR アゴニストと MCs の脱顆粒が刺激されます。
Protocol
Representative Results
Discussion
MC モデルは、三菱商事の脱顆粒、走化性、接着、同様 MC 活性化に関与する細胞内のシグナル伝達経路を解明する研究を正常に使用できます。臍帯由来不死化線 (LAD2 および HMC1) など人間の MCs 使用人間 MCs のモデルいくつかの研究者は血 (CD133 陽性) 前駆細胞と末梢血前駆細胞 (CD34 陽性)。他の齧歯動物の不死化など、MC のモデル (ラット好塩基性白血病 RBL-2 H 3 MC ライン) またはプライマリ培養…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、肥満細胞作製、培養での技術支援のジュリア Geminn を認識したいと思います。この作品は、イ共同研究センター (TR SFB) 152 によって支えられました。
Materials
| RPMI Medium | Thermo Scientific | 21875034 | |
| DPBS | Sigma-Aldrich | 14190144 | |
| FCS | Thermo Scientific | R92157 | |
| IL-3 | R&D Systems | 403-ML | |
| SCF | Thermo Scientific | PMC2115 | |
| Concanavalin A | Sigma-Aldrich | C2272 | |
| Fura-2 AM | Thermo Fischer Scientific | F1221 | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | |
| DNP-HSA | Sigma-Aldrich | A6661 | |
| Anti-DNP-Antibody | Sigma-Aldrich | D-8406 | |
| Penstrep | Thermo Scientific | 15140122 | |
| Compound 48/80 | Sigma-Aldrich | C2313 | |
| 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol | Sigma-Aldrich | X100 | |
| 4-Nitrophenyl 2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranoside | Sigma-Aldrich | N9376 | |
| CoverWell Imaging Chamber | Sigma-Aldrich | GBL635051 | |
| 96-Well plate, v-shaped bottom | Corning | 3896 | |
| 96-Well plates, flat bottom | Greiner Bio-One | 655180 | |
| Microtiter plate reader with "i-control" software | Tecan | Nano Quant, infinite M200 Pro | |
| Flat bottom plate | Greiner Bio-One | 655180 | |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I9657 | |
| 50 mL Plastic Centrifuge Tubes | Sarstedt | 62.547.254 | |
| Culture Flasks (25 cm) | Greiner Bio-One | 69160 | |
| Cover slips glasses round; ø 25 mm; No. 1 | Menzel | CB00250RA1 | |
| Hemocytometer | VWR | 631-0696 | |
| Inverted Microscope | Zeiss | Observer Z1 | |
| Objectiv Fluar 40x/1.3 Oil | Zeiss | 440260-9900 | |
| HC Filter Set Fura 2 | AHF | H76-521 | |
| CCD Camera | Zeiss | AxioCam MRm | |
| Monochromatic Light Source | Sutter Instruments | Lambda DG-4 | |
| Imaging Acquisition Program | Zeiss | AxioVision 4.8.2 | |
| Gravity fed solution application system | Custom Made | 4-channel | |
| 15 mL Plastic Centrifuge Tubes | Sarstedt | 62,554,502 | |
| Bench Centrifuge | Heraeus | Megafuge 1.0R |
References
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