Isolamento do peritônio-derivado de mastócitos e sua caracterização funcional com Ca^{2 +}-imagens e ensaios de degranulação

MCs desempenham um papel proeminente durante respostas de imune inatas e adquiridas. Especificamente, MCs participarem na morte de patógenos, como bactérias e parasitas e também degradam peptídeos endógenos potencialmente tóxicos ou componentes de venenos (para revisão, consulte Galli et al . 2008¹). O papel fisiológico de MCs na inata e imunidade adaptativa é objecto de debate acalorado. Portanto, as inúmeras discrepâncias de dados nos estudos realizados com diferentes modelos de rato MC-deficientes exigem uma reavaliação sistemática de funções imunológicas de MCs além de alergia². MCs maduros são localizadas principalmente em tecidos e órgãos como a pele, pulmão e intestino e normalmente são encontrados apenas em pequenas quantidades no sangue. MCs derivam de precursores hematopoiéticos, como progenitores de MC e completar a sua diferenciação e maturação no microambiente que de quase todos os tecidos vascularizados¹. Fator derivado de T-células interleucina (IL) -3 promove seletivamente a viabilidade, proliferação e diferenciação de uma população de pluripotentes de rato MCs de seus progenitores hematopoiéticos³. Fator de célula-tronco (SCF) é produzido por células estruturais nos tecidos e desempenha um papel crucial no desenvolvimento da MC, sobrevivência, migração e função⁴. As propriedades de MCs individuais podem variar dependendo de sua capacidade de sintetizar e armazenar várias proteases ou proteoglicanos. Nos ratos, os tipo de tecido conjuntivo chamados MCs são distintos dos MCs da mucosa de acordo com sua localização anatômica, morfologia e conteúdo de heparina e proteases⁵.

No MCs, um aumento de livre citosólico Ca^{2 +} ([Ca^{2 +}]_eu) é indispensável para a degranulação e a produção de eicosanoides, bem como para a síntese de citocinas e a ativação de fatores de transcrição em resposta ao antígeno e vários secretagogues⁶. Um grande alvo a jusante estes estímulos é a fosfolipase C que hidrolisa fosfatidilinositol 4,5-bisfosfato diacilglicerol (DAG) e inositol 1, 4,5-triphosphate. DAG ativa a proteína quinase C e IP3 libera íons de Ca^{2 +} do retículo endoplasmático. Esgotamento destas lojas ativa Ca^{2 +} fluxo através da membrana plasmática Ca^{2 +} canais, levando para armazenar a entrada de cálcio operados (SOCE). Este processo é evocado através da interação do Ca^{2 +}-sensor, estromais interação molécula-1 (Stim1), no retículo endoplasmático com Orai1⁷ , bem como através da ativação de canal potencial de (TRPC) canônico transitória do receptor proteínas (para revisão, ver Freichel et al . 2014⁸) na membrana plasmática.

Para estudar o papel fisiológico desses canais, vários farmacológicos (aplicação de bloqueadores dos canais) ou abordagens genéticas são normalmente usadas. Neste último caso, supressão da expressão da proteína é alcançado pela segmentação do mRNA (“knockdown”) ou edição de DNA genômico com exclusão global ou tecido-específica⁹ de um exon codificação um poro formando a subunidade de um canal (nocaute). A disponibilidade de um bloqueador com especificidade suficiente para estes canais é limitada. Além disso, a abordagem “knockdown” requer controle cuidadoso de sua efetividade, usando, por exemplo., Western blot análise e é dificultado pela indisponibilidade de anticorpos específicos para a proteína do alvo do canal em muitos casos. Assim, o uso de modelos de rato nocaute ainda é considerado como o padrão ouro para tal análise. Um modelo preferencial em vitro para a investigação das funções do MC é o cultivo da EPM que pode ser isolada ex vivo como uma população totalmente madura (em oposição a diferenciar MCs em vitro de, por exemplo., células da medula óssea)¹⁰ . Em comparação com MCs derivada de medula óssea (BMMCs), que também são comumente usados para estudar MC função em vitro, a estimulação de FcεRI e beta-hexosaminidase lançamento é aumento 8-fold e 100-fold na EPM, respectivamente. Neste artigo, descrevemos um método de isolamento e cultivo de murino PMCs, que permite para obter após 2 semanas de cultivo um elevado número de puro tecido conjuntivo digite MCs, suficientes para uma análise mais aprofundada.

Apesar dos recentes progressos no desenvolvimento e aplicação de indicadores de cálcio geneticamente codificado, seu uso é ainda limitado por dificuldades na entrega de genes nas células-alvo, especificamente, em células altamente especializados como principais culturas MCs. Além disso, este grupo de indicadores fluorescentes para [Ca^{2 +}]_eu medições ainda carece de corantes ratiometric com uma alta gama dinâmica. Por estas razões, o método preferido para a medição ratiometric [Ca^{2 +}]_eu ainda é o uso do corante fluorescente “Fura-2”¹¹.

Atualmente, os mais usados abordagem para a avaliação da ativação de MC e degranulação é a medição da atividade de β-hexosaminidase. Β-hexosaminidase, um mediador alérgico, é um dos componentes do grânulo de MC que é co lançado com histamina em proporção constante de MCs¹². Β-hexosaminidase pode ser prontamente e com precisão medido através de sua reação com um substrato específico, que produz uma quantidade mensurável de um produto de colorigenic que é facilmente detectável em um ensaio colorimétrico de microplacas. Neste artigo, é relatada uma aplicação desta técnica de análise de degranulação PMCs em resposta a uma variedade de estímulos.

Agregação de receptor de IgE plasmalemmal de alta afinidade (FcɛRI) ativa no MCs versátil via de sinalização intracelular, levando a uma liberação do conteúdo do grânulo secretor no espaço extracelular circundante. O antígeno específico, além de muitos outros estímulos podem ativar MCs para liberar um diversificado leque de mediadores de imunomoduladores, como anafilatoxinas do complemento (ex., C3a e C5a)¹³, a vasoconstritor peptídeo endotelina 1 (ET1)¹⁴ , como bem como numerosas substâncias catiônicas e drogas provocando reações pseudoallergic (EG., Icatibanto)¹⁵ por ligação a MRGPRX2¹⁶. Vias de sinalização intracelulares envolvido na degranulação induzida por MRGPR MCs caracterizam-se mal em comparação com FcɛRI mediada por sinalização intracelular; essas vias só começaram a ser estudada intensamente durante os últimos poucos anos¹⁷ após o receptor identificação¹⁶. Em grande parte, os canais iônicos de membrana plasmática envolvidos na entrada de cálcio, seguida de estimulação MRGPRX2 permanecem para ser compreendido. Portanto, o presente artigo centra-se na sinalização intracelular do cálcio e degranulação de MCs estimulada com agonistas MRGPR.