Isolierung von Mastzellen Bauchfell abgeleitet und deren funktionelle Charakterisierung mit Ca^{2 +}-imaging und Degranulation Assays

MCs spielen eine herausragende Rolle bei angeborenen und erworbenen Immunantwort. Insbesondere MCs teilnehmen an der Tötung von Krankheitserreger wie Bakterien und Parasiten, und auch potentiell toxischen endogene Peptide oder Komponenten der Gifte (für Überprüfung siehe Galli Et Al. 2008¹) abgebaut. Die physiologische Rolle von MCs in angeborenen und der adaptiven Immunität ist Gegenstand hitziger Debatten. Daher erfordern zahlreiche Daten Diskrepanzen in den Studien mit verschiedenen MC-defizienten Maus-Modellen eine systematische Neubewertung der immunologischen Funktionen von MCs über Allergie². Reife MCs sind meistens in Geweben und Organen wie Darm, Haut und Lunge beschränkt und sind in der Regel nur in geringen Stückzahlen im Blut gefunden. MCs stammen aus hämatopoetischen Vorläufer, wie z. B. MC Stammväter, und füllen Sie ihre Differenzierung und Reifung in die Mikroumgebungen von fast allen vaskularisierte Gewebe¹. T-Cell-derived Factor Interleukin (IL)-3 fördert gezielt die Lebensfähigkeit, Proliferation und Differenzierung von pluripotenten Einwohner Maus MCs aus ihrer hämatopoetischen Vorläuferzellen³. Stem Cell Factor (SCF) entsteht durch strukturelle Zellen in den Geweben und spielt eine entscheidende Rolle in der MC-Entwicklung, überleben, Migration und Funktion⁴. Die Eigenschaften der einzelnen MCs können je nach ihrer Fähigkeit zu synthetisieren und verschiedenen Proteasen oder Proteoglykane zu speichern. Bei Mäusen sind die so genannten Bindegewebe-Typ MCs von Schleimhaut MCs entsprechend ihrer anatomischen Lokalisation, Morphologie und Inhalte von Heparin und Proteasen⁵unterscheiden.

In MCs, ein Anstieg von freien cytosolischen Ca^{2 +} ([Ca^{2 +}]_ich) ist unentbehrlich für die Degranulation und Produktion von Eicosanoids sowie für die Synthese von Zytokinen und Aktivierung von Transkriptionsfaktoren in Reaktion auf Antigen und verschiedenen Secretagogues⁶. Eine nachgeschaltete Hauptziel dieser Reize ist Phospholipase C, die Phosphatidylinositol-4,5-Bisphosphate Diacylglycerol (DAG) und Inositol-1,4,5-Trisphosphate hydrolysiert. DAG aktiviert Proteinkinase C und IP3 gibt Ionen von Ca^{2 +} aus dem endoplasmatischen Retikulum frei. Raubbau an diesen Geschäften aktiviert Ca^{2 +} Zustrom durch Plasmamembran Ca^{2 +} Kanäle, was zu betriebenen Kalzium Eintrag (SOCE) speichern. Dieser Prozess wird hervorgerufen durch das Zusammenspiel von Ca^{2 +}-Sensor, Stromale Interaktion Molekül-1 (Stim1), in dem endoplasmatischen Retikulum mit Orai1⁷ sowie durch die Aktivierung von Transienten Rezeptor potenzielle kanonische (TRPC) Kanal Proteine (für Überprüfung siehe Freichel Et al. 2014-⁸) in der Plasmamembran.

Zur Untersuchung werden die physiologische Rolle dieser Kanäle, mehrere pharmakologische (Anwendung des Kanal-Blocker) oder gentechnische Ansätze in der Regel verwendet. Im letzteren Fall wird die Unterdrückung der Proteinexpression durch gezielte mRNA (Zuschlag) erreicht oder genomischer DNA mit globalen oder gewebespezifische⁹ löschen ein Exon Codierung eine Pore bilden Untereinheit eines Kanals (Knockout) bearbeiten. Die Verfügbarkeit eines Blockers mit ausreichender Spezifität für diese Kanäle beschränkt. Darüber hinaus der Knockdown Ansatz erfordert sorgfältige Kontrolle über seine Effektivität verwenden, z. B.., Western blot Analyse, und durch das Fehlen von spezifischen Antikörpern für die gezielte Kanal-Protein in vielen Fällen behindert wird. So ist die Verwendung von Knockout-Maus-Modellen nach wie vor als Goldstandard für eine solche Analyse betrachtet. Eine bevorzugte in Vitro Modell zur Untersuchung von MC-Funktionen ist der Anbau von PMCs, die isolierte ex Vivo als voll ausgereifte Population werden können (im Gegensatz zu differenzieren MCs in Vitro aus, zB., Knochenmarkzellen)¹⁰ . Im Vergleich zu dem Knochenmark abgeleitet MCs (BMMCs), die auch häufig verwendet werden, zu studieren, MC-Funktion in Vitro, die Stimulation der FcεRI und Beta-Hexosaminidase Release 8-fach und 100fach PMCs, bzw. erhöht. In diesem Artikel beschreiben wir eine Methode zur Isolierung und Kultivierung von murinen PMCs, die es erlaubt, um zu erhalten, nach 2 Wochen der Kultivierung einer hohen Anzahl von reinen Bindegewebe MCs, ausreichend für die weitere Analyse geben.

Trotz der jüngsten Fortschritte in der Entwicklung und Anwendung von genetisch codierte Kalzium Indikatoren ist deren Nutzung noch durch Schwierigkeiten bei der Lieferung von Genen an Zielzellen, insbesondere in hoch spezialisierten Zellen wie primäre kultivierten MCs begrenzt. Darüber hinaus fehlt diese Gruppe von fluoreszierenden Indikatoren für [Ca^{2 +}]_ich Messungen noch ratiometrischen Farbstoffe mit einem hohen Dynamikumfang. Aus diesen Gründen ist die bevorzugte Methode für ratiometrischen [Ca^{2 +}]_ich Messung noch die Verwendung von fluoreszierenden Farbstoff “Fura-2”¹¹.

Derzeit die am häufigsten verwendete Ansatz für die Bewertung von MC-Aktivierung und Degranulation ist die Messung der Aktivität der β-Hexosaminidase. Β-Hexosaminidase, eine allergische Mediator ist eine MC Modul Komponenten, die in einem konstanten Verhältnis von MCs-¹²zusammen mit Histamin freigegeben ist. Β-Hexosaminidase ist leicht und präzise durch die Reaktion mit einem speziellen Substrat messbar erzeugt eine messbare Menge eines Colorigenic Produkts, das in einer Mikrotestplatte kolorimetrischen Probe leicht nachweisbar ist. In diesem Artikel wird eine Anwendung dieser Technik für die Analyse von PMCs Degranulation in Reaktion auf eine Vielzahl von Reizen berichtet.

Aggregation von der hohen Affinität plasmalemmal IgE-Rezeptor (FcɛRI) wird im MCs eine vielseitige intrazellulären Signalweg führt zu einer Freisetzung von sekretorischen Granulat Inhalt in den extrazellulären Raum aktiviert. Neben den spezifischen Antigen, können viele andere Reize aktivieren MCs um vielfältige immunmodulatorische Mediatoren wie Ergänzung Anaphylatoxins freizugeben (zB., C3a und C5a)¹³, Vasokonstriktor Peptid Endothelin 1 (ET1)¹⁴ , als auch zahlreiche kationischen Substanzen und Drogen pseudoallergische Reaktionen zu provozieren (zB., Icatibant)¹⁵ durch Bindung an MRGPRX2¹⁶. Intrazelluläre Signalwege MRGPR-induzierte MCs Degranulation beteiligt sind schlecht im Vergleich zu FcɛRI-vermittelten intrazelluläre Signale gekennzeichnet; Diese Wege erst während der letzten paar Jahre¹⁷ nach der Rezeptor Identifikation¹⁶intensiv untersucht werden. Weitgehend, bleiben die Plasmamembran Ionenkanäle beteiligt Kalzium Eintrag gefolgt von MRGPRX2 Anregung verstanden werden. Daher der vorliegende Artikel konzentriert sich auch auf intrazellulären Calcium-Signalisierung und Degranulation der MCs mit MRGPR Agonisten stimuliert.