Un sang à base d’essai pour la détection des ROS1 et RET transcrits de Fusion de circuler l’acide ribonucléique Using Digital Polymerase Chain Reaction

Les instructions du fabricant sont suivies pour les réactifs énumérées ci-dessous, sauf indication contraire. Les tests de PCR sont des produits disponibles dans le commerce destinés à détecter les fusions ROS1 et RET. 1. travail avec de l’ARN en vue de la Transcription inverse (RT)-dPCR : bonnes pratiques de laboratoire Créer un environnement exempt de RNase lorsque vous travaillez avec de l’ARN. Utilisez commercialement disponible en aérosol conçu pour inactiver RNases contaminantes. Utilisation certifiée exempte de RNase réactifs, conseils et tubes. Conseils de barrière pour pipettes permet d’empêcher l’introduction des ribonucléases ou contamination croisée des échantillons. Toujours porter un manteau de laboratoire afin d’empêcher les particules tombent sur les vêtements de votre échantillon. Désigner un laboratoire manteau spécifique à utiliser avec l’ARN. Porter des gants pour éviter la contamination des échantillons de ribonucléases dans la peau. Changer fréquemment.Remarque : Supposons que des surfaces de laboratoire sont contaminés par la RNase puisqu’elles sont exposées à l’environnement. Gants qui en contact avec la peau, cheveux, poignées de porte, poignées de congélateur, stylos/marqueurs, etc. sont censés pour ne plus être libre de RNase. Décontaminer les pipettes, benchtops, centrifugeuses et autres surfaces de travail avec une RNase inactivation spray à avant utilisation. Si possible, maintenir un ensemble d’équipement pour un usage avec de l’ARN. Minimiser les perturbations des flux d’air dans les zones de laboratoire lorsque vous travaillez avec des échantillons d’ARN empêchant les particules de tomber dans des échantillons ou de contaminer la zone de travail. Magasin purifiée RNA à-80 ° c. Évitez les multiples gel-dégel des échantillons d’ARN, car ceci peut causer la dégradation. 2. génération de matériel d’ARN analytique pour les contrôles positifs Conception ADN synthétique à l’aide de séquences d’ADN messagère publiées pour les variantes de la fusion d’intérêts10. Pour une variante de fusion donnée, sélectionnez une séquence de fusion d’ARNm qui comprend le site de fusion ainsi qu’une longueur suffisante d’accompagnement de chaque côté pour couvrir l’amplicon PCR. Sélectionner des séquences de nucléotides entre 50 et 250 nt pour imiter la taille des RNA capturée à l’aide de plasma enrichi en plaquettes en circulation. Ajouter une séquence promotrice de T7 (5′-CAGAGATGCATAATACGACTCACTATAGGGAGA-3′) à l’extrémité 5′ de la séquence cible. Commander des séquences synthétiques que fragments double brin d’acide désoxyribonucléique (ADN). Reconstituer l’ADN synthétique dans un tampon Tris-EDTA (TE) à une concentration finale de 10 ng/µL. Convertir les ADN synthétique de 60 ng d’ARN utilisant in vitro de transcription. Purifier les ARN transcrits à l’aide du réactif à base de phénol/guanidine12. Inclure la DNase I, RNase-libre pour supprimer le modèle résiduel ADN. Mesurer la concentration de purifiée en vitro ARN utilisant un fluorimètre disponible dans le commerce avec les normes et les colorants propres RNA. S’assurer que l’ARN est dans la plage acceptable pour les normes choisies. Dilution peut être exigée. Confirmer la transcription réussie par électrophorèse sur gel à l’aide d’un gel d’agarose 2 % mélangé avec tache de gel RNA et une gamme haute échelle RNA, y compris la gamme de taille 50-250 nt. Charge 500 ng de chaque in vitro ARN sur un gel. Exécutez le gel à 5 V/cm. Visualiser les bandes individuelles à l’aide d’illumination et de documenter les résultats. Confirmer la taille de la transcription prévue pour chacune des variantes fusion (basés sur la conception à l’étape 2.1.2). Confirmer la détection de chaque in vitro ARN par RT-dPCR utilisant appariés variante spécifique PCR assay (voir les étapes 5 à 8 du présent protocole). En option : Préparer un mélange équimolaire de in vitro ARN qui contient chacune des variantes de la fusion et le gène contrôle GUSB. Si étape 2.9 est effectuée : confirmer la détection de chacune des variantes fusion inclus dans le mélange de contrôle par dPCR utilisant la PCR variante spécifique (voir les étapes 5 à 8 du présent protocole). Déterminer la concentration d’entrée souhaitée pour des contrôles positifs analytiques en testant des concentrations allant de 0,25 à 2,5 fg10. Choisir la concentration basée sur la sortie numéro de copie désirée. Après confirmation, préparer 10 µL à usage unique d’extraits de l’ARN analytique à utiliser dans le contrôle positif (étape 4.4) et les conserver à-80 ° c. 3. les donateurs spécimens Prélever les échantillons de sang total humain de 10 mL dans les tubes de prélèvement sanguin (BCT) de 10 mL contenant un conservateur de RNA acellulaire.Remarque : Tous les donneurs humains donneront leur consentement à l’utilisation de la recherche et aucune information d’identification propres donateurs est recueillie ou utilisée au cours des essais. Traiter des échantillons de sang total dans le délai indiqué par le fabricant de la BCT. Pool de plasmas humains normaux peut être acheté d’une source commerciale pour une utilisation dans le contrôle positif analytique. Préparation à usage unique, 1 ml de la pool de plasmas humains normaux et les conserver à-80 ° c pour une utilisation avec le contrôle positif (étape 4.4). 4. récupération des ARN du Plasma en circulation Remarque : Il est important de travailler rapidement au cours de cette procédure. Centrifuger les tubes de sang total à 200 x g pendant 20 min. Recueillir jusqu’à 4 mL de plasma du tube de prélèvement de sang centrifugé à l’aide d’une pipette sérologique. Veillez à ne pas déranger ou aspirer la couche leuco. Isoler l’ARN circulant à l’aide d’un kit disponible dans le commerce qui peut capturer les RNA acellulaire du plasma, les plaquettes et les exosomes. Isoler l’ARN de l’échantillon de contrôle positif aux côtés de chaque lot. Préparer le contrôle positif pour chaque lot d’échantillons cliniques comme suit : Décongeler 1 mL pooled plasma humain normal aliquote (étape 3.3). Décongeler la quantité analytique RNA 10 µL (étape 2.12). Préparer, contrôle positif en ajoutant 10 µL RNA analytique dans l’échantillon de plasma humain normal une fois que l’éthanol a été ajouté au plasma lysat. Éluer les échantillons avec de l’eau exempte de nucléase 100 µL. Procéder immédiatement, nettoyer avec de l’ARN et la concentration. Échantillons peuvent être stockés sur la glace humide et à couvert, jusqu’à une heure. Concentrer les ARN utilisant la méthode de la colonne en fonction et éluer à 9 µL d’eau exempte de RNase. Procéder immédiatement à l’étape 5, ou conserver les échantillons sur la glace humide jusqu’à une heure. 5. reverse Transcription de l’ARN d’ADNc Échantillon de RNA concentré circulation convertir cDNA utilisant un kit de réaction de transcription inverse disponibles dans le commerce, y compris amorces aléatoires (voir le tableau 1 pour les composants).Remarque : Des amorces spécifiques de gènes sont facultatifs et peuvent être conçus pour les variantes de test. Amorces sont conçus selon l’objectif de la séquence d’ARN. Utiliser des séquences variant de fusion du point 2.1. Inclure aucun échantillon de contrôle de la transcriptase inverse et aucun échantillon de contrôle RNA (voir tableau 1). Isoler l’ADNc de la réaction de transcription inverse en utilisant une colonne de spin de concentrateur ADN disponible dans le commerce.Remarque : Cette étape facilite l’élimination des enzymes, des amorces et gratuit désoxyribonucléosides triphosphates (dNTPs). Utiliser cDNA immédiatement dans les réactions de PCR ou stocker à-80 ° c. 6. digital PCR Remarque : Cette PCR est spécifique aux gouttelettes numérique PCR (voir Table des matières). Précautions PCR de mélange. Porter un blouson manteau et nitrile de laboratoire jetables. Utilisation PCR mélanger les réactifs dans une zone de préparation du réactif dédié. Ne pas manipuler les ADNc dans la zone de préparation de réactif seule. Couvrir les sondes alors qu’il travaillait pour les protéger de la lumière. La lumière excessive peut photo le colorant fluorescent relié à la sonde d’eau de Javel. Transport mixes, couverts et protégés de la lumière, sur une aire séparée de pré-amplification avant cDNA doit être ajouté. Ajouter ADNc à tester au mélange de la PCR dans une hotte de PCR clean situé dans quartier de pré-amplification. Préparer les mélanges PCR pour un volume de réaction finale de 20 µL selon le tableau 2. Distribuer les mélanges PCR + cDNA pour plaques PCR.Remarque : Utilisation d’un schéma comme un guide est recommandé. Couvrir la plaque à l’aide d’un adhésif amovible. Centrifuger les plaques brièvement pour prélever des échantillons au fond des puits. Mix sur agitateur de plaque sur un réglage bas pendant 10 s. Centrifuger les plaques brièvement pour recueillir l’échantillon au fond du puits. Retirer l’adhésif. Effectuer la génération de gouttelettes pour PCR-cDNA mélange soit avec un système de génération de gouttelettes manuel ou automatisé. Pour la génération manuelle de gouttelettes, virement mélange PCR 20 µL puits d’échantillon sur la cartouche de génération de gouttelettes. Ajouter 70 µL d’huile de génération de gouttelettes. Couvrir avec la cartouche de joint d’étanchéité et de transfert de caoutchouc au générateur de gouttelettes manuel pour lancer la génération de gouttelettes. Après la génération de gouttelettes, transfert gouttelettes sur une plaque PCR fraîche à l’aide de conseils recommandés par le fabricant. Aspirer et distribuer les gouttelettes lentement, en 5 à 6 s chacun, sans toucher l’ouverture de l’embout de la cartouche de gouttelettes ou de la plaque. Pour la génération automatisée de gouttelettes, sceller la plaque avec un opercule et le transfert dans le générateur de gouttelettes. S’assurer que tous les conseils, cartouches, et les plaques sont en place avant de commencer la production de gouttelettes. Après la génération de gouttelettes et transfert des gouttelettes sur une plaque PCR fraîche, joint avec un adhésif aluminium et plaques de cycle thermique en utilisant les paramètres dans le tableau 3. Après le thermocycleur série est terminée, lisez la plaque à l’aide d’un lecteur de gouttelettes. Créer un schéma pour le logiciel de lecteur qui identifie l’emplacement des contrôles, échantillons, etc.et la charge dans le logiciel pour démarrer la lecture. 7. analyse et l’examen et la génération des résultats Analyser les résultats à l’aide de logiciels disponibles dans le commerce de lecture de la plaque. Accédez au menu analyser pour voir deux dimensions (2D) amplitude de terrains. Évaluer la qualité globale des données en examinant les données de gouttelettes. Évaluer les données pour les numéros d’événement accepté total en utilisant le menu événements. S’il y a moins de 10 000 événements par puits, évaluer avec soin les données pour des problèmes supplémentaires. Vérifier les données pour les amplitudes de fluorescence aberrante. Différences d’amplitude significative et les différences de concentration entre échantillons répétés indiquent la mauvaise manutention ou mélange d’échantillons. Prendre des notes, des grappes de gouttelettes avec modèles de pulvérisation sur un axe de 45 degrés, ce qui dénote des gouttelettes de mauvaise qualité ou échantillons problématiques. Examiner les données de contrôle positif, N° de la Transcriptase inverse (RT N°) et No RNA contrôle (CNRC) tout d’abord. Sélectionnez tous les échantillons de contrôle et d’analyser des cluster qualité de tracé 2D. Pour le seuil approprié, une séparation nette entre les clusters de gouttelettes devrait être évidente. Pour chaque variante de test, définissez le seuil basé sur les puits de contrôle. Set de seuils sur les parcelles 2D à l’aide de l’outil de ligne de mire de séparer la population de gouttelettes de double négation de la population de gène témoin (étiqueté avec sonde de 5′-hexachloro-fluorescéine-CE phosphoramidite), axe y et population variant de gène, si présent) marqué avec fluorescéine amidite sonde 6-carboxyfluorescéine OR), axe des abscisses. Somme des copies de chaque puits répétées pour un seul échantillon. Exprimer les résultats des tests comme le nombre d’exemplaires variant détecté.Remarque : Pour déterminer la valeur de seuil analytique permettant d’appeler un échantillon positif ou négatif, exécuter une normale échantillon donneur sain mis (au moins 10 échantillons individuels) à travers le processus de finalisation et d’établir le seuil au-dessus de n’importe quel signal détectable de fond pour la mutation de intérêt. En outre, établir le nombre de copies du gène contrôle requis pour appeler un résultat positif ou négatif. Ce seuil de gène de contrôle fonctionne comme un contrôle de qualité interne (QC) pour évaluer la quantité et la qualité de chaque échantillon de RNA qui est traitée. 8. vérification des Conditions de réaction de RT-dPCR utilisant des lignées cellulaires (facultatives) Pour vérifier la détection de variants de fusion, utiliser commercialement disponibles lignées cellulaires exprimant la fusion ROS1 ou RET ADN messagère d’intérêt. Procédez comme suit : Homogénéiser les cellules congelées flash dans une solution de lyse guanidinium base directement à partir de l’état congelé. Même bref dégel avant homogénéisation peut causer une perte et dégradation de l’ARN. Isoler l’ARN à l’aide de colonnes à centrifuger silice-membrane conçues pour l’ARN. Mesurer la concentration des échantillons d’ARN à l’aide d’un fluorimètre avec des normes et des réactifs spécifiques de RNA. Diluer les ARN dans un fond d’ARN sauvage de plasma ou d’une autre source commerciale. Effectuer les étapes de Reverse Transcription de l’ARN à l’ARNC, PCR numérique et l’analyse des données et examen et génération de résultats figurant dans le présent protocole pour confirmer la détection de la variante désirée.