A Blood-based Test for the Detection of ROS1 and RET Fusion Transcripts from Circulating Ribonucleic Acid Using Digital Polymerase Chain Reaction

Hestia S. Mellert; Kristin E. Alexander; Leisa P. Jackson; Gary A. Pestano

doi:10.3791/57079

JoVE Journal > Medicine

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Medicine

الدم على أساس اختبار للكشف عن ROS1 و RET المستنسخات الانصهار من تعميم الحمض النووي الريبي استخدام الرقمية تفاعل البوليميراز المتسلسل

Published: April 05, 2018

doi:

10.3791/57079

Hestia S. Mellert¹, Kristin E. Alexander¹, Leisa P. Jackson¹, Gary A. Pestano¹

¹Biodesix

Summary

كشف تعميم الحمض النووي الريبي (كرنا) من الدم حاجة غير ملباة في التشخيص السريري. هنا يمكننا وصف الأساليب التي تميز كرنا من مرضى سرطان الرئة الخلية غير الصغيرة استخدام حساسة ومحددة الرقمية تفاعل البوليميراز المتسلسل. الاختبارات تلبية متطلبات التصميم للكشف عن المتغيرات الانصهار في غضون 72 ساعة.

Abstract

قمنا بتطوير أساليب جديدة لعزل وتوصيف المستمدة من ورم يتناقل الريبي (كرنا) لخزعة سائلة على أساس الدم. كشف قوية من كرنا المستردة من الدم يمثل حلاً لحاجة غير ملباة حاسمة في التشخيص السريري. ويبدأ الاختبار بجمع الدم كله في أنابيب جمع الدم المحتوية على المواد الحافظة إلى استقرار كرنا. الخلية الحرة، اكسوسومال، والجيش الملكي النيبالي الصفائح الدموية المرتبطة يتم عزل من البلازما في اختبار هذا النظام. كرنا عكس نسخها للحمض النووي التكميلية (كدنا) وتضخيم استخدام الرقمية البلمرة المتسلسل (دبكر). يتم تقييم عينات للعلامات البيولوجية المستهدفة فضلا عن مورثة عنصر تحكم. اختبار التحقق من صحة إدراج الحد من الكشف، والدقة، ومتانة الدراسات مع نماذج تحليلية. الكشف عن الطريقة التي تم تطويرها نتيجة لهذه الدراسات تكاثر متعددة الانصهار المتغيرات ROS1 (proto-oncogene ج-روس الخيارين 1؛ 8) والمقصود بالصندوق (ترتيبها خلال proto-oncogene تعداء؛ 8 المتغيرات). وقد تم تحسين سير العمل معالجة العينة حيث أن نتائج الاختبار يمكن أن تتولد دائماً خلال 72 ساعة استلام العينة.

Introduction

تصل إلى 25% من الخلايا غير الصغيرة سرطان الرئة (NSCLC) المرضى قد لا يكون الأنسجة كافية متوفرة للاختبار في وقت التشخيص. حتى في الحالات التي تتوفر فيها الأنسجة، قد لا تكون كافية كمية أو نوعية أداء المستحسن الاختبارات الجزيئية¹^،². وفي الحالات التي يوجد فيها ما يكفي من الأنسجة من خزعة للتنميط الجزيئي، المرضى قد تضطر إلى الانتظار عدة أسابيع أو أكثر للحصول على النتائج، أو البدء في العلاج بدون نتائج الجزيئية³^،⁴. ومع ذلك، من الأهمية بمكان أن يكون التشخيص الجزيئي الزاخر بالمعلومات المتاحة نظراً إلى ظهور عدة خيارات العلاج الموجهة للمرضى الذين شخصت NSCLC. اختبار المتداولة دون خلايا الحمض النووي (كفدنا) من خزعة سائلة إيجاد حل لتحديات الأنسجة التقليدية اختبار⁴^،^،من⁵⁶. وتشمل خيارات الاختبار الحالية للتنفيذ الطفرات في NSCLC باستخدام كفدنا وسير عمل المستندة إلى دبكر مماثلة لتوليد نتائج سريعة، ومستقبلات عامل نمو البشرة (EGFR) توعية الطفرات ΔE746-A750 و L858R، EGFR الطفرات المقاومة T790M ، متغيرات كراس Proto-Oncogene (كراس)، والبديل بروتوونكوجيني ب-سلاح الجو الملكي البريطاني (براف) V600E. على الرغم من أن لا اعتمد على أوسع نطاق حسب الحقل، تعميم المستمدة من ورم رسول الحمض النووي الريبي (مرناً) المعزولة من خزعة سائلة يمكن أن توفر أيضا المعلومات السريرية الهامة⁷^،^،من⁸⁹. ونحن سابقا وضعت وأبلغ عن أساليب الكشف متعدد Microtubule Echinoderm البروتينات المرتبطة مثل 4-المتحولة لمفوما مستقبلات التيروزين كيناز (EML4-كيه) الانصهار المتغيرات من بلازما الدم¹⁰. في هذه الدراسة، فإننا بمد هذه الأساليب تشمل أعلى ترتيب متعدد الأهداف الجيش الملكي النيبالي ROS1 والمقصود بالصندوق، الذي يغطي ثمانية متغيرات الانصهار داخل كل مقايسة. وكان الهدف تطوير تقنية سريعة وحساسة ومحددة واستنساخه للكشف عن هذه المتغيرات الانصهار من البلازما للمرضى الذين شخصت سابقا NSCLC.

تبدأ عملية اختبار في مكتب الطبيب باستخدام الحمض النووي الريبي استقرار أنابيب جمع الدم¹¹. تحتوي هذه الأنابيب على خلية الصائن كذلك مثبطات رناسي. عينات هي الأولوية التي يتم شحنها بين عشية وضحاها إلى مركزية المعتمدين في الكلية الأمريكية كاب الباثولوجيا اﻻكلينيكي تحسين مختبر التعديلات (العملية)-المختبرات المعتمدة (المختبرات الطبية) للمعالجة بموظفين أكفاء. وبمجرد تلقي “المختبرات السريرية”، تجري كل خطوة لتجهيز تحت “إجراءات التشغيل الموحدة” المعتمدة (SOP). يتم تثفيل الدم كله لاسترداد البلازما، ثم تستخدم لعزل الحمض النووي الريبي التي أما تعميم الحرة في الدم أو داخل تغليف مويتيس، مثل اكسوسوميس والصفائح الدموية⁷^،^،من⁸⁹. لعزل الحمض النووي الريبي من هذه المقصورات، اخترنا نظام استرداد الجيش الملكي النيبالي استناداً إلى مقارنات بين عدة أساليب الاستخراج. الجيش الملكي النيبالي المعزول مركزة وعكس نسخها إلى كدنا. وقيمت عدة الإشعال الخاصة بالجينات والأنزيمات المنتسخة العكسية خلال الاستغلال الأمثل لأسلوب التوليف كدنا لتعظيم ROS1 والمقصود بالصندوق المستهدفة نسخة التحويل¹⁰. هذا أمر بالغ الأهمية لوفرة منخفضة تعميم النصوص، مثل المتغيرات المشتقة من ورم الانصهار. وأخيراً، نحن الأمثل دبكر تركيزات التمهيدي والتحقيق للسماح للكشف عن متعدد المتغيرات الانصهار المقصود بالصندوق أو ROS1 ومراقبة الجينات، جلوكورونيداسي-β (جوسب). نحن ثم ضم أفضل الظروف من كل الدراسات الأمثل إلى بروتوكول تخوض نهائي قبل إجراء دراسات تحليلية التحقق من الصحة المبينة في هذا التقرير. هذا البروتوكول وهذه النتائج أساسا لسير عمل السريع وحساسة للكشف عن المتغيرات الانصهار نادرة في الدورة الدموية الروتينية.

Protocol

يتم اتباع تعليمات الشركات المصنعة الكواشف المذكورة أدناه، إلا إذا تم وصفه. فحوصات PCR هي المنتجات المتاحة تجارياً مصممة للكشف عن اندماج ROS1 والمقصود بالصندوق. 1-العمل مع الجيش الملكي النيبالي في التحضير للنسخ العكسي (RT)-دبكر: مختبر أفضل الممارسات تهيئة بيئة خالية من رناسي عند العمل مع الجيش الملكي النيبالي. استخدام المرشات المتوفرة تجارياً تهدف إلى إلغاء تنشيط رنسيس تلويث. استخدام شهادة خالية من رناسي الكواشف والنصائح، وأنابيب. استخدام تلميحات الحاجز بيبيتورس لمنع إدخال رنسيس أو التلوث عبر العينات. دائماً ارتداء معطف مختبر لمنع الجسيمات من الوقوع من الملابس في النموذج الخاص بك. تعيين محدد معطف مختبر لاستخدامها مع تجهيز الجيش الملكي النيبالي. ارتداء قفازات لمنع تلوث العينة من رنسيس في الجلد. تغيير القفازات في كثير من الأحيان.ملاحظة: تفترض مختبر السطوح الملوثة رناسي نظراً لأنهم معرضون للبيئة. قفازات اتصل بالجلد، الشعر، مقابض الأبواب، مقابض المجمد، والأقلام/علامات، إلخ يفترض أن تكون لم تعد خالية من رناسي. إزالة التلوث من بيبيتورس، بينتشتوبس، وأجهزة الطرد المركزي، والأسطح الأخرى العمل مع المنظمة رناسي رذاذ مسبقة لاستخدام. إذا كان ذلك ممكناً، الاحتفاظ بمجموعة من المعدات للاستخدام مع الحمض النووي الريبي فقط. تقليل تعطل تدفق الهواء في مناطق مختبر عند العمل مع عينات الحمض النووي الريبي لمنع الجسيمات من الوقوع في عينات أو تلويث منطقة العمل. مخزن تنقية الحمض النووي الريبي في ˚C-80. تجنب يذوب تجميد العديد من عينات الحمض النووي الريبي، كما يمكن أن يسبب هذا التدهور. 2-جيل من مادة الحمض النووي الريبي التحليلية لعناصر إيجابية التصميم باستخدام الحمض النووي الاصطناعية نشر متواليات مرناً للمتغيرات الانصهار لفائدة10. بالنسبة لمتغير معين انصهار، حدد تسلسل انصهار مرناً يتضمن الموقع الانصهار بالإضافة إلى طول كاف المرافقة على كل جانب لتغطية PCR amplicon. حدد تسلسل النوكليوتيدات بين 50-250 nt لتقليد حجم تداول رنا التقاطها باستخدام البلازما الغنية بالصفائح الدموية. إضافة تسلسل مروج T7 (-كاجاجاتجكاتاتاكجاكتكاكتاتاججاجا 5 ‘-3’) إلى 5 ‘ نهاية تسلسل المستهدفة. ترتيب تسلسل الاصطناعية كشظايا مزدوج تقطعت بهم السبل الحمض الخلوي الصبغي (DNA). إعادة تشكيل الحمض النووي الاصطناعية في المخزن المؤقت تريس يدتا (TE) بتركيز نهائي 10 نانوغرام/ميليلتر. تحويل 60 نانوغرام الاصطناعية الحمض الخلوي الصبغي للجيش الملكي النيبالي باستخدام النسخ في المختبر . تنقية النصوص الجيش الملكي النيبالي باستخدام كاشف الفينول/جوانيداين-تعتمد12. وتشمل الدناز الأول، خالية من رناسي لإزالة قالب المتبقية الحمض النووي. قياس تركيز المنقاة في المختبر الحمض النووي الريبي استخدام fluorometer متاحة تجارياً مع الأصباغ الخاصة بالجيش الملكي النيبالي والمعايير. ضمان الجيش الملكي النيبالي ضمن النطاق المقبول للمعايير المختارة. قد يكون التخفيف المطلوب. تأكيد النسخ الناجحة بالتفريد جل استخدام 2% [اغروس] هلام مختلطة مع الحمض النووي الريبي جل وصمة عار ومجموعة عالية سلم الجيش الملكي النيبالي بما في ذلك نطاق الحجم nt 50-250. تحميل 500 نانوغرام لكل في المختبر الجيش الملكي النيبالي على هلام. تشغيل الجل الخامس 5/سم. تصور واحد العصابات باستخدام الإضاءة، وتوثيق النتائج. تأكيد حجم نسخة المتوقعة لكل من الخيارين الانصهار (استناداً إلى التصميم في الخطوة 2.1.2). تأكيد الكشف عن كل في المختبر الجيش الملكي النيبالي ب RT-دبكر استخدام المتطابقة الخاصة بمتغير PCR المقايسة (انظر الخطوات 5-8 من هذا البروتوكول). اختياري: إعداد أن خليط اكويمولار في المختبر الجيش الملكي النيبالي الذي يحتوي على كل من الخيارين الانصهار والجينات التحكم جوسب. إذا كان يتم تنفيذ الخطوة 2.9: تأكيد الكشف عن كل من الخيارين الانصهار المدرجة في الخليط التحكم بها دبكر استخدام فحوصات PCR الخاصة بمتغير (راجع الخطوات من 5-8 من هذا البروتوكول). تحديد تركيز الإدخال المطلوب لعناصر إيجابية التحليلية عن طريق اختبار تركيزات تتراوح بين 0.25 إلى 2.5 جي10. اختر تركيز استناداً إلى إخراج عدد النسخ المطلوبة. وعقب تأكيد، إعداد 10 ميليلتر استخدام واحد مختبرين لتحليل الحمض النووي الريبي للاستخدام في مراقبة إيجابية (الخطوة 4، 4) ومخزن في ˚C-80. 3-الجهات المانحة العينات جمع عينات دم كل البشر 10 مل في أنابيب جمع الدم 10 مل (BCT) تتضمن كمادة حافظة الحمض النووي الريبي خالية من خلية.ملاحظة: جميع المانحين البشرية يجوز الموافقة على استخدام البحث وجمع لا معلومات التعريف الخاصة بالجهات المانحة أو استخدامها أثناء الاختبار. تجهيز عينات الدم كله في الإطار الزمني المحدد بواسطة الشركة المصنعة BCT. ويمكن شراء المجمعة البلازما البشرية العادية من مصدر تجاري لاستخدامها في مراقبة إيجابية تحليلية. يعد استخدام واحد، ومختبرين 1 مل بلازما الإنسان العادي المجمعة ومخزن في-80 ˚C للاستخدام مع مراقبة إيجابية (الخطوة 4، 4). 4-استرداد تعميم الجيش الملكي النيبالي من البلازما ملاحظة: من المهم العمل بسرعة من خلال هذا الإجراء. الطرد المركزي أنابيب الدم كله في 200 غ س لمدة 20 دقيقة. جمع يصل إلى 4 مل بلازما من أنبوب جمع تثفيل الدم استخدام ماصة مصلية. احرص على عدم الإزعاج أو نضح طبقة معطف بافي. عزل الحمض النووي الريبي تعميم استخدام عدة متاحة تجارياً التي يمكن التقاط اكسوسوميس، والصفائح الدموية، والجيش الملكي النيبالي الخلية خالية من البلازما. عزل الحمض النووي الريبي من عينة مراقبة إيجابية جنبا إلى جنب مع كل دفعة. تعد “سيطرة إيجابية” لكل دفعة من العينات السريرية على النحو التالي: ذوبان الجليد 1 مل تجمع عادي البلازما البشرية اليكووت (الخطوة 3، 3). ذوبان الجليد 10 ميليلتر تحليلية الحمض النووي الريبي قاسمة (الخطوة 2.12). إعداد مراقبة إيجابية بإضافة 10 ميليلتر تحليلية الجيش الملكي النيبالي في عينات البلازما البشرية العادية حالما تم إضافة الإيثانول إلى البلازما ليستي. الوت العينات بمياه خالية من نوكلاس 100 ميليلتر. الشروع فورا في الجيش الملكي النيبالي تنظيف وتركيز. قد العينات المخزنة على الجليد الرطب، وتغطيتها، ليصل إلى ساعة واحدة. يركز الجيش الملكي النيبالي باستخدام العمود على أساس الأسلوب والوت في 9 ميليلتر من المياه خالية من رناسي. الشروع فورا في الخطوة 5، أو الاحتفاظ بعينات على الجليد الرطب لمدة ساعة واحدة. 5-عكس النسخ من الحمض النووي الريبي لكدنا تحويل مركزة من عينة الحمض النووي الريبي يتناقل كدنا استخدام عدة رد فعل نسخ عكسي متوفرة تجارياً، بما في ذلك كبسولة تفجير عشوائي (انظر الجدول 1 للمكونات).ملاحظة: الجينات محددة هي اختيارية ويمكن أن تكون مصممة لاختبار المتغيرات. يتم تصميم كبسولة تفجير استناداً إلى الهدف تسلسل الحمض النووي الريبي. استخدام تسلسلات الانصهار البديل من “الخطوة 2-1”. وتشمل لا نموذج عنصر تحكم المنتسخة العكسية ولا عينة مراقبة الحمض النووي الريبي (انظر الجدول 1). عزل كدنا من رد فعل النسخ العكسي استخدام عمود دوران مركزات الحمض النووي متاحة تجارياً.ملاحظة: وتسهل هذه الخطوة إزالة الإنزيمات والإشعال، والحر ديوكسينوكليوتيدي تريفوسفاتيس (دنتبس). استخدام كدنا فورا في ردود الفعل PCR أو تخزين في ˚C-80. 6-الرقمية [بكر] ملاحظة: هذا بكر محددة إلى الحبرية PCR الرقمية (انظر الجدول للمواد). مزيج PCR الاحتياطات. ارتداء قفازات معطف والنتريل مختبر المتاح. استخدام PCR مزيج الكواشف في مجال إعداد كاشف مخصصة. لا تتعامل مع كدنا في مجال إعداد كاشف فقط. وتشمل تحقيقات مع العمل على حمايتهم من الضوء. الضوء المفرط يمكن أن صور بليتش صبغة الفلورسنت يعلق على التحقيق. النقل يمزج، غطت ومحمية من الضوء، في منطقة ما قبل تضخيم منفصلة قبل كدنا هو المراد إضافتها. إضافة كدنا أن تختبر لمزيج PCR في غطاء نظيفة بكر الواقعة في المنطقة قبل التضخيم. إعداد يمزج PCR لوحدة تخزين رد نهائي من 20 ميليلتر وفقا الجدول 2. توزيع يمزج PCR + كدنا إلى لوحات PCR.ملاحظة: استخدام تخطيط لوحة كما ينصح بدليل. وتغطي اللوحة السدادة لوحة قابلة للإزالة باستخدام. الطرد المركزي لوحات بإيجاز لجمع العينات في الجزء السفلي من الآبار. المزيج على لوحة شاكر على إعداد منخفض لمدة 10 ق. الطرد المركزي لوحات بإيجاز لجمع العينة في أسفل البئر. قم بإزالة لوحة السدادة. أداء الجيل الحبرية لمزيج PCR-كدنا أما مع نظام جيل الحبرية يدوية أو تلقائية. لتوليد الحبرية اليدوي، ونقل 20 ميليلتر بكر ميكس إلى الآبار عينة على خرطوشة جيل الحبرية. إضافة ميليلتر 70 الحبرية توليد النفط. تغطية مع خرطوشة المطاط طوقا ونقل إلى مولد الحبرية اليدوي الشروع في توليد الحبرية. بعد جيل الحبرية، نقل قطرات إلى لوحة بكر جديدة باستخدام النصائح الموصى بها من قبل الشركة المصنعة. نضح والاستغناء عن القطرات ببطء، على مدى 5 إلى 6 s كل، دون لمس افتتاح تلميح إلى خرطوشة الحبرية أو لوحة. لتوليد الحبرية الآلي، وختم اللوحة مع ختم إحباط ونقل إلى مولد الحبرية. ضمان جميع النصائح، الخراطيش، ولوحات في المكان قبل البدء في توليد الحبرية. بعد جيل الحبرية ونقل قطرات إلى لوحة بكر طازجة، ختم مع السدادة لوحة من إحباط، ولوحات دورة حرارية باستخدام الإعدادات الموجودة في الجدول 3. بعد cycler الحرارية تشغيل كاملة، قراءة لوحة باستخدام قارئ الحبرية. إنشاء تخطيط لوحة للبرمجيات القارئ أن يحدد موقع عناصر التحكم، العينات، إلخ، وتحميل في البرمجيات لبدء القراءة. 7-بيانات تحليل واستعراض، وتوليد النتائج تحليل لوحة قراءة النتائج باستخدام البرمجيات المتاحة تجارياً. انتقل إلى القائمة تحليل لعرض قطع السعة ثنائي الأبعاد (2D). تقييم الجودة الشاملة للبيانات عن طريق فحص البيانات التجميعية. تقييم البيانات للحدث المقبولة مجموع أرقام استخدام قائمة الأحداث. إذا كان هناك أقل من 10,000 الأحداث لكل بئر، بعناية تقييم البيانات المتعلقة بمشاكل إضافية. التحقق من صحة البيانات للاتساع الأسفار الشاذة. اختلافات كبيرة السعة وتركيز الفروق بين العينات تكرار الإشارة إلى سوء المناولة أو خلط العينات. جعل ملاحظات مجموعات الحبرية مع أنماط رذاذ على محور 45 درجة، مما يدل على قطرات نوعية رديئة أو عينات إشكالية. فحص بيانات التحكم الإيجابي ولا عكس المنتسخة (لا RT) ومراقبة الحمض النووي الريبي لا (NRC) أولاً. حدد كل عنصر تحكم نماذج ودراسة نوعية الكتلة بمؤامرة 2D. للعتبة الصحيحة، ينبغي فصل واضح بين مجموعات الحبرية الظاهر. بالنسبة لكل متغير المقايسة، تعيين عتبة استناداً إلى مراقبة الآبار. تعيين العتبات في 2D قطع الأرض باستخدام أداة مرمى لفصل السكان الحبرية النفي المزدوج من مراقبة الجينات السكان (المسمى بمسبار فوسفوراميديتي 5 ‘-سداسي-فلوريسسين-CE)، والمحور الصادي، والسكان الجين البديل، وإذا كان تقديم ( وصفت مع أميديتي فلوريسسين أو 6-كاربوكسيفلوريسسين التحقيق)، المحور س. مجموع نسخاً من كل بئر تكرار لنموذج واحد. التعبير عن نتائج الاختبار كعدد النسخ الخيار الكشف.ملاحظة: لتحديد قيمة استقطاع تحليلية لاستدعاء عينة إيجابية أو سلبية، تشغيل عادي عينة المانحة صحية تعيين (على الأقل 10 عينات فردية) من خلال عملية وضع الصيغة النهائية وإنشاء قطع أعلاه أي إشارة خلفية قابلة للكشف لتحول الفائدة. بالإضافة إلى ذلك، إنشاء عدد النسخ الجيني التحكم المطلوبة للاتصال بنتيجة إيجابية أو سلبية. وظائف هذا الوقف الجينات التحكم كعنصر تحكم الجودة داخلية (QC) لتقييم كمية ونوعية لكل عينة من الحمض النووي الريبي التي تتم معالجتها. 8-تحقق شروط رد فعل دبكر RT باستخدام خطوط الخلايا (اختياري) للتحقق من الكشف عن المتغيرات الانصهار، استخدام خطوط الخلايا المتوفرة تجارياً معربا عن الانصهار ROS1 أو المقصود بالصندوق مرناً للفائدة. المضي قدما على النحو التالي: مجانسة فلاش تجميد الخلايا في أحد حلول المستندة إلى جوانيدينيوم تحلل مباشرة من الدولة المجمدة. يمكن أن يسبب ذوبان الجليد قصيرة حتى قبل تحقيق التجانس تدهور الجيش الملكي النيبالي والخسارة. عزل الحمض النووي الريبي استخدام أعمدة تدور السليكا-غشاء مصممة للجيش الملكي النيبالي. قياس تركيز عينات الحمض النووي الريبي استخدام فلوروميتير مع الكواشف الخاصة بالجيش الملكي النيبالي والمعايير. تمييع عزل الحمض النووي الريبي إلى خلفية من الحمض النووي الريبي البرية من نوع من البلازما أو مصدر تجاري آخر. القيام بخطوات من “عكس النسخ من الحمض النووي الريبي” لكدنا، بكر الرقمية، وتحليل البيانات ومراجعة، و “توليد النتائج” الواردة في هذا البروتوكول تأكيد الكشف عن الخيار المطلوب.

Representative Results

ويصف هذا البروتوكول نظام اختبار للكشف عن الحمض النووي الريبي الانصهار المتغيرات لاستخدامها في قياس الطفرات سائق داخل البلازما لمرضى NSCLC (الشكل 1أ). وحددت مرناً الانصهار كانت المنتجات من التعبير عن ترتيبات جديدة المقصود بالصندوق و ROS1 الأكثر شيوعاً بين السكان NSCLC13،،من1415،،من1617. ثم صممت متعدد PCR فحوصات للكشف عن المتغيرات نسخة الثمانية الأكثر شيوعاً لكل هدف في NSCLC داخل فعل واحد. المولدة الأكثر شيوعاً في محور ROS1 إنشاء رابطات مع الأجزاء 5 ‘ CD74، SDC4، SLC34A2، EZR أو TPM3 الجينات (الشكل 1ب). يؤدي المولدة الأكثر شيوعاً في المكان المقصود بالصندوق بالتوازي مع KIF5B، الذي يغطي المقايسة ستة تقاطعات إكسون. وتشمل شركاء الصندوق الإضافية التي تغطي تلك مع CCDC6 و TRIM33 (الشكل 1ج). في المجموع، فحوصات تغطي حوالي 88 في المائة من ROS1 و 99% من التعديلات المقصود بالصندوق المعروف تحدث في السكان المريض NSCLC17. تم تقييم الطابع الخاص لمكونات الإنزيم أولاً استخدام ثمانية الفردية في المختبر الكشف التي تحتوي على تسلسل مرناً للنصوص الانصهار تغطيها ROS1 أو المقصود بالصندوق متعدد فحوصات. تم اختبار كل الأنواع الجيش الملكي النيبالي ضد كل مقايسة البديل الفردية التي تشمل إصدار متعدد. وكان هناك لا ه من هذه الاختبارات، مدللة بذلك على 100% خصوصية تحليلية داخل تصميم متعدد فحوصات (البيانات لا تظهر). لتحديد الحد الأدنى للكشف عن بروتوكول الاختبار، كانت مختلطة مجموع الجيش الملكي النيبالي المستمدة من خطوط الخلايا معربا عن متغير انصهار المدرجة في المقايسة إلى خلفية من الجيش الملكي النيبالي العادي عند تركيزات 5%، 1%، 0.2%، و 0.04 في المائة. متعدد المقصود بالصندوق و ROS1 البديل بكر فحوصات الكشف عن أقل من 0.2% الانصهار البديل (الشكل 2أ-ب). بالإضافة إلى ذلك، إعداد 5 ٪ قبالة المستهدفة خط الخلية المشتقة من الحمض النووي الريبي (التعبير عن نسخة انصهار EML4-كيه) لم يتم الكشف عنه مع فحوصات ROS1 والمقصود بالصندوق متعدد، مما يدل كذلك على خصوصية (الشكل 2أ-ب). وأجرى اختبار دقة عملية دبكر RT لكلا ROS1 وتمت معالجة التحليلية متقاعد مراقبة المواد تتألف من اكويمولار في المختبر الكشف تركيزات ثلاث (عالية ومتوسطة ومنخفضة) من خلال النسخ العكسي ودبكر على ثلاثة مناسبات مختلفة داخل نفس اليوم (داخل-اليوم)، في ثلاثة أيام متتالية (بين اليوم)، ومع مشغلي اثنين (بين المشغل). وأظهرت النتائج من اختبار دقة الكشف دقيقة نسخة الانصهار للفائدة، فضلا عن مراقبة جينات، جوسب، الذي تم تضمينه كمقياس مراقبة الجودة داخلية (الشكل 2-د). بالإضافة إلى المراقبة الداخلية جوسب، تم تشغيل كل دفعة من العينات السريرية مع مجموعة من عناصر المجموعة. تم تطوير عنصر تحكم إيجابية من خليط من التحليل في المختبر الحمض النووي الريبي التي تمثل كل من الخيارين الانصهار اختبارها في الرايت دبكر، فضلا عن التحليل في المختبر الحمض النووي الريبي جوسب. وقد ارتفعت في بلازما الإنسان العادي أثناء استخراج الحمض النووي الريبي هذا الجيش الملكي النيبالي وتمت معالجتها جنبا إلى جنب مع العينات السريرية في جميع أنحاء البروتوكول. وكان عنصر التحكم المنتسخة العكسية (أي RT) لا عنصر تحكم سلبية للتأكد من عدم وجود مواد ملوثة في سير العمل استخراج الحمض النووي الريبي وتثبت خصوصية كبسولة تفجير للحمض النووي الريبي. عنصر التحكم لا RT تم إنشاؤها باستخدام نفس المواد كعنصر إيجابي، ولكنه لا يشمل الإنزيم داخل رد فعل التوليف كدنا. أي من سيطرة الجيش الملكي النيبالي (المجلس النرويجي للاجئين) عنصر تحكم سلبية لتأكيد عدم تلويث النصوص في مكونات رد فعل النسخ العكسي. عرض عنصر التحكم هذا في سير العمل في خطوة توليف كدنا، وتمت إضافة المياه في رد الفعل بدلاً من قالب الجيش الملكي النيبالي. يجب أن تكون عناصر التحكم لا RT والمجلس النرويجي للاجئين سلبية في كل القنوات، إذا كانت نتائج دقيقة لتسليمها. الجدول 1 قوائم مكونات رد فعل النسخ العكسي لكل عنصر تحكم. تظهر الأمثلة من المؤامرات 2D لكل من عناصر التحكم هذه ROS1 (الشكل 3 أ-ج) والمقصود بالصندوق (الشكل 3 ه-ز) فحوصات متعدد. المتغيرات الانصهار تم الكشف عن استخدام مجس أميديتي (الاتحاد الماليزي) fluorescein وهي ممثلة على طول المحور الصادي، بينما تحكم الجينات، جوسب، تم الكشف عن استخدام مجس 5 ‘-سداسي-فلوريسسين-م فوسفوراميديتي (ست عشري) وعلى المحور س. تم تقييم هذه الضوابط دفعة على مدى 21 يوما لتحديد متانة المقايسة. لوحظت الانصهار الإيجابي قطرات وقطرات الجينات التحكم جوسب ROS1 والمقصود بالصندوق في كافة المجريات 21 المنفذة خلال فترة الدراسة (الشكل 3د، ح). كافة عناصر سلبية (RT لا والمجلس النرويجي للاجئين) أسفرت عن نتائج سلبية عبر كامل 21 يوما (البيانات لا تظهر). القدرة على استكشاف أخطاء وإصلاحها عنصر حاسم لأي بروتوكول اختبار ليتم تشغيلها في وضع المختبرات السريرية. هنا، نحن نقدم أمثلة العالم الحقيقي من نتائج دون المستوى الأمثل باستخدام بروتوكول دبكر RT. الأولى مؤامرة 2D مثال مما يدل على أهمية لا عنصر التحكم المنتسخة العكسية (الشكل 4أ). في هذا المثال، متحولة قطرات إيجابية كانت موجودة حتى ولو كان هناك لا تحويل كدنا الواجب لعدم وجود الإنزيم. هذه النتيجة على الأرجح بسبب الإشعال دبكر تضخيم الحمض النووي خارج الهدف. وفي هذه الحالة، سوف يمنع تصميم مقايسة التي تغطي إنترون تضخيم الحمض النووي. بدلاً من ذلك، يمكن استخدام إنزيم الدناز رناسي خالية للقضاء على تلويث الحمض النووي، ولكن هذا غير مستحسن للكشف عن أهداف نادرة، كما قد تحدث بعض التدهور الجيش الملكي النيبالي خلال الاحتضان مع الإنزيم. وكان المؤامرة 2D المثال التالي المجلس النرويجي لاجئين مع قطرات إيجابيا في كلتا القناتين (الشكل 4ب). هذا أشار إلى تلوث في مرحلة الإعداد دبكر RT. وفي هذه الحالة، هو التوصية تجاهل أي يحتمل أن تكون ملوثة والكواشف المستخدمة في الاختبار ودقة تطهير جميع المعدات، وإعادة اختبار مع مكونات الطازجة رد فعل. مثال 2D الأرض الثالث قدم كرذاذ من قطرات على طول خط 45 درجة (الشكل 4ج). غالباً ما يحدث هذا بسبب القص وائتلافه من قطرات. دقيق الحبرية معالجة قبل ركوب الدراجات الحرارية ضروري، كما قطرات عرضه للتلف. نوصي باستخدام الجيل الآلي الحبرية، عندما تكون متاحة. إذا كان نقل يدوياً إنشاء قطرات، تكون معينة لاختيار النصائح تحمل على نطاق الموصى بها وتستخدم تقنية بيبيتينج دقيق. ويتطلب نقل الحبرية تطلع بطيئة وصرفها، مع كل مكان أخذ أكثر من 5-6 ثانية، ومن الضروري أن افتتاح نصيحة ماصة لا تلمس خرطوشة الحبرية أو جيدا. عند الاستغناء عن، تبقى نصيحة ماصة على مستوى السائل ورفعه ببطء كما قطرات تخليها (عرض فيديو لمظاهرة). يوضح المثال مؤامرة 2D النهائي عدم الفصل بين الحبرية الإيجابية والسلبية من السكان (الشكل 4). قد يكون لعدة أسباب. مثبطات “بكر قوية”، مثل المنظفات المستخدمة في المخازن المؤقتة لتحلل ووجود فائض من الحمض النووي المتدهورة جداً، يمكن أن يسبب فقدان للانفصال. وفي هذه الحالة، النظر في إضافة خطوة تنظيف كدنا التوليف بين دبكر (مثل الموصوفة في الخطوة 5 من هذا البروتوكول). وأخيراً، كما يمكن عدم الفصل بسبب ظروف التضخيم دون المستوى الأمثل، وينبغي النظر أيضا في الاستفادة المثلى من هذه الخطوة PCR. البيانات داخل الشكل 5 تمثل 984 العالم الحقيقي المريض عينة مرات الدوران ويوضح طبيعة سير العمل هذا الاختبار السريع. ذكر الطبيب مبكرا كالنتائج خلال 48 ساعة (79% حالات) لاستلام العينة، وفي 95% من الحالات، في غضون 72 ساعة. وفي الختام، استقرت تعميم الحمض النووي الريبي أنابيب جمع الدم، إجراءات استخراج الحمض النووي الريبي الأمثل من الدم، و RT-دبكر تشغيل وفقا لبروتوكول أمثل مع المناسبة داخلية والمجموعة عناصر التحكم، يمكن أن يوفر الاستخدام نظام اختبار سريع كشف دقيقة من الانصهار الحمض النووي الريبي المتغيرات ذات الصلة في NSCLC. الشكل 1 : لمحة عامة عن “خطوات تجهيز عينة الدم” “الانصهار الكشف البديل” باستخدام “فحوصات محددة” إلى RET الأكثر انتشارا ومتغيرات ROS1 في NSCLC- (أ) اختبار العينة يتم البدء عندما يتم رسمها كل الدم ويتم شحنها BCT داخل عدة جمع العينات إلى “مختبر السريرية”. يتم استرداد تعميم الجيش الملكي النيبالي من مصادر متعددة داخل البلازما الغنية بالصفائح الدموية، عكس نسخها مع فتيلة الجينات محددة، وتنقية للاستخدام في دبكر. تتم معالجة العينات باستخدام نظام متاحة تجارياً التي تتألف من جيل الحبرية (مستحلب)، التضخيم، والعد الحبرية. ويتم تحليل البيانات باستخدام البرمجيات المتاحة تجارياً. ثم توثيق نتائج الاختبار وإبلاغها إلى الطبيب طلب الاختبار. تم تصميم العملية للعمل ضمن إطار زمني مدته 72 ساعة من استلام العينة للإفراج عن النتيجة. المتغيرات الثمانية ل ROS1 (ب) و (ج) المقصود بالصندوق مشمولة ضمن فحوصات متعدد. مقتبس من موقع بيوديسيكس مع الإذن. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- الشكل 2 : التحقق من صحة التحليل. خطوط الخلايا معربا عن (أ) SDC4-ROS1 الانصهار والانصهار (ب) CCDC6-RET كانت مخففة في خلفية من المجموع في البشرية من البرية من نوع الحمض النووي الريبي (الرنا WT). مع كل متغير الانصهار، أنشئ الحد من الكشف عن 0.2% تردد متغير باستخدام معايير محددة مسبقاً لفحص كل متغير. جميع العينات هذه العتبة الواردة أيضا نسخ مالا يقل عن 21 من التحكم في الجينات. تم اختبار معيار EML4-كيه (كيه) 5% في خلفية من البرية من نوع الحمض النووي الريبي لإثبات خصوصية المقايسة، التي تأكدت بنتيجة سلبية. وقيست التحليل متعدد المعايير الجيش الملكي النيبالي في عالية، متوسطة، وتم تقييم تركيزات منخفضة ل ROS1 (ج) و (د) متقاعد الدقة على تشغيل ثلاثة في نفس اليوم (داخل-اليوم)، يدير ثلاثة في ثلاثة أيام متتالية (بين اليوم)، ومع مشغلي المستقلة اثنين (بين المشغل). يتم إظهار عدد النسخ والانحرافات المعيارية. مقتبس من موقع بيوديسيكس مع الإذن. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- الشكل 3 : دفعة تجهيز الأمثلة على التحكم والبيانات متانة. نتائج 2D قطعة دبكر الإنزيم ROS1 متعدد لمراقبة إيجابية (أ)، (ب) لا التحكم المنتسخة العكسية، و (ج) لا تحكم قالب الجيش الملكي النيبالي. تم تشغيل عناصر التحكم (د) على 21 يوما على التوالي (باستثناء عطلة نهاية الأسبوع وأيام العطل). يعني عدد النسخ +/-الانحرافات المعيارية ل ROS1 الإيجابية كانت تحكم 439 +/-141. لا المنتسخة العكسية وأية عناصر تحكم قالب أيضا تشغيل في كل يوم، وهذه كلها كانت سلبية (البيانات لا تظهر). نتائج 2D قطعة دبكر المقايسة المقصود بالصندوق متعدد لمراقبة إيجابية (ه)، (و) لا التحكم المنتسخة العكسية و (ز) لا تحكم قالب الحمض النووي الريبي. تم تشغيل عناصر التحكم (ح) على 21 يوما على التوالي (باستثناء عطلة نهاية الأسبوع وأيام العطل). يعني نسخ +/-الانحرافات المعيارية للصندوق الإيجابية كانت تحكم 586 +/-182. لا تظهر لا المنتسخة العكسية ولا عناصر القالب التي تم تشغيلها كما في كل يوم، وكانت كلها سلبية. مقتبس من موقع بيوديسيكس مع الإذن. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- الشكل 4 : استكشاف الأخطاء وإصلاحها RT-دبكر. 2D مؤامرات تمثل نتائج دون المستوى الأمثل دبكر الحصول عليها عندما يكون هناك () تلوث داخل أي سيطرة المنتسخة العكسية، (ب) التلوث داخل أي سيطرة الجيش الملكي النيبالي، (ج) القص وائتلافه من قطرات، و (د ) الأمثل سوء ظروف PCR أو تثبيط PCR. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- الشكل 5 : الفترة الزمنية (تأت). تم تصنيف تأت (بالساعات) للاختبارات التي تطلب متغير الحمض النووي الريبي (n = 984). بيانات باستثناء عطلات نهاية الأسبوع والعطلات، وعينات > 24 ساعة بسبب نقص المعلومات السريرية في معمل “اختبار نماذج طلبات”. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- الجدول 1: إعداد الكواشف النسخ العكسي لمراقبة العملية. المكون وحدة التخزين 2 × سوبيرميكس دبكر لتحقيقات(لا 2 ‘–ديوكسيوريديني 5-ثلاثي) 10 ميليلتر تعيين الهدف البديل 20 x كبسولة تفجير/تحقيقات(450 نمول/لتر الإشعال، 250 مسبار الاتحاد الماليزي نمول/لتر) 1 ميليلتر 20 x مجموعة الإشعال/التحقيق الهدف التحكم(450 نمول/لتر الإشعال، 250 مسبار HEX نمول/لتر) 1 ميليلتر المياه خالية من نوكلاس 1 ميليلتر كدنا 7 ميليلتر الجدول 2: إعداد مزيج الرئيسي دبكر. الخطوة ركوب الدراجات درجة الحرارة الوقت # دورات معدل المنحدر تنشيط إنزيم 95 درجة مئوية 10 دقيقة 1 ~ 2 سج/s تمسخ 94 درجة مئوية 30 s 40 الصلب/ملحق 55 درجة مئوية 1 دقيقة إبطال مفعول إنزيم 98 درجة مئوية 10 دقيقة 1 عقد (اختياري) 4 درجة مئوية بلا حدود 1 ~ 1 سج/s الجدول 3: شروط الدراجات الحرارية.

Discussion

ترتيبات جديدة المقصود بالصندوق و ROS1 يشكلون معا ~ 3% الطفرات سائق داخل السكان NSCLC¹⁸. على الرغم من النادر، الكشف عن هذه التعديلات الوراثية أمر حيوي. مرضى NSCLC مع هذه التعديلات قد تستفيد من العلاجات المستهدفة التي تعوق النشاط كيناز الشاذة التي تنتج من البروتين أونكو¹³على وجه التحديد. بعض هذه العلاجات هي سبق أن وافقت عليها إدارة الأغذية والعقاقير للاستخدام في ROS1 NSCLC إيجابية، بينما البعض الآخر أظهرت أن تكون فعالة ضد المقصود بالصندوق في التجارب السريرية¹⁹.

بكر التكنولوجيا الرقمية توفر الحساسية التي مثالية ل التطبيقات خزعة سائلة²⁰. هناك اعتماد كبير لهذه التكنولوجيا للاستخدام مع تعميم خالية من خلايا الحمض النووي لقياس الورم طفرات في مرضى NSCLC⁴^،^،من⁶²¹^،^،من²²²³ . بالإضافة إلى كفدنا، قمنا بتطوير بروتوكول مصمم لقياس قوة المتغيرات الانصهار الأكثر انتشارا في مرضى NSCLC من تعميم الورم الحمض النووي الريبي (الشكل 1أ)¹⁰.

لدينا البروتوكول المعمول يسمح لحدود التحليلية للكشف وصولاً إلى 0.2% (الشكل 2). أن RT-دبكر استثنائية محددة وحساسة، فحوصات تقتصر على لوحة المتغيرات الانصهار المعروفة التي يتم اختيارها ومتعدد للكشف في التحليل PCR. وبالتالي، يجب تحديد الأنشطار التي ستدرج في فحوصات متعدد بعناية لضمان التغطية المناسبة للسكان من مرضى NSCLC. لقد قمنا بتصميم الاختبارات بنجاح للمقصود بالصندوق و ROS1 في نفس الوقت الكشف عن ثمانية الانصهار المتغيرات الناتجة عن ترتيبات جديدة للمكان المقصود بالصندوق أو ROS1 وتغطي 99% و 88% من السكان إيجابية المقصود بالصندوق و ROS1، على التوالي (الشكل 1ب-ج )¹⁷.

سير الاختبار النهائي كما هو موضح في هذه الدراسة يتضمن عناصر تحكم دفعة لضمان اتساق نتائج. وتشمل هذه الضوابط معيار تحليل إيجابية فضلا عن عنصري تحكم السلبية، التي تكفل معا لا يوجد تلوث أو تثبيط PCR التي تحدث داخل المجموعة (الشكل 3). ولضمان متانة المقايسة، أجرى دراسة استخدام الضوابط دفعة خلال فترة 21 يوما (الشكل 3د، ح). وتبين هذه البيانات اتساق عملية الجيش الملكي النيبالي المنصوص عليها في هذا البروتوكول.

الممارسات المختبرية الجيدة والتعامل مع الحمض النووي الريبي المناسبة من المكونات الرئيسية لضمان نتائج قوية ودقيقة. مختبر الفضاء ومعدات مخصصة للاستخدام مع الجيش الملكي النيبالي، تنظيف المعدات بعد كل استعمال واستخدام خالية رناسي الكواشف والمواد الاستهلاكية وتطبيق رذاذ المنظمة رناسي إلى مساحة العمل كل ما يساعد على الحد من تلويث رنسيس. معالجة الضميري من عينات الحمض النووي الريبي من الفنيين، بما في ذلك معطف مختبر مخصص، كثرة التغييرات القفازات، والعمل بسرعة من خلال إجراءات استخراج الحمض النووي الريبي، وحفظ العينات في الثلج، ذات أهمية قصوى للحفاظ على سلامة العينة. الجيش الملكي النيبالي بمجرد عكس نسخها إلى كدنا، تكون العينة في شكل أكثر استقرارا يمكن أن يكون أقل عرضه للتدهور. بالإضافة إلى الممارسات التي تدعم سلامة الحمض النووي الريبي، ينبغي الاحتفاظ بعينات ومكونات PCR في مناطق معزولة لمنع التلوث المتبادل يمكن أن تؤدي إلى نتائج إيجابية خاطئة. الأسهم PCR الكواشف وإعداد يمزج PCR الرئيسي ينبغي أن تظل منفصلة من قوالب بكر وينبغي اتخاذ عناية كبيرة لفصل قالب تضخيم (وظيفة-PCR) من جميع مواد تضخيم مسبقاً بما في ذلك الكواشف، والجيش الملكي النيبالي، وكدنا عينات. وأخيراً، جيل سليم وتناول مستحلب يمزج PCR قبل التضخيم المركزية للحفاظ على سلامة الحبرية والظروف المثلى دبكر. والاحتياطات مثل هذه الحرجة أثناء تنفيذ هذا البروتوكول للحصول على نتائج متسقة ودقيقة. ينبغي دراسة جميع البيانات موظفون مدربون قبل الإفراج عن النتائج أن تتأكد من الوفاء بجميع المقاييس ومراقبة الجودة. في حالة الحصول على نتائج دون المستوى الأمثل (الشكل 4)، يجب مراجعتها بواسطة الموظفين التقنيين ومدير مختبر الدفعة وقد تتطلب إعادة المعالجة.

يمكن أن تنتج نتائج دبكر RT أقرب وقت 24 ساعة من استلام العينة و 95% من نتائج العينة داخل اختبار تعيين المستخدمة في هذه الدراسة (n = 984) أفيد أن يأمر الطبيب في أقل من 72 ساعة من وقت استلام (الشكل 5). يوفر هذا الوقت تحول الأطباء مع الكثير بحاجة إلى المعلومات الجزيئية في إطار الزمني الذي يتيح البدء بالعلاج المناسب. هذه النتائج متوفرة عادة في وقت سابق من تلك التي تم الحصول عليها باستخدام خزعة نسيج تقليدية. إضافية المؤشرات الحيوية ل NSCLC وغيرها من أنواع السرطان يمكن تطويرها باستخدام النهج القائمة على الحمض النووي الريبي يتناقل مماثلة، وأن تستفيد نفس الوقت-إلى-نتائج سريعة. على سبيل المثال، يمكن قياس النص مرناً المبرمجة الموت [ليغند] 1 (PD-L1) استخدام الرايت دبكر إبلاغ الأطباء حول خيارات العلاج المناعي. وهناك أيضا اهتمام متزايد بفائدة خزعة سائلة ودبكر في الرصد للفعالية العلاجية. مؤشرات سابقة لعودة ظهور الورم باستخدام الجينوم اختبار لمتغيرات محددة يمكن أن يسمح الأطباء لضبط نظم العلاج قبل المرضى أعراض وفق المعايير المتعلقة بتدابير الرعاية مثل التصوير²⁴. بروتوكولات مثل تلك التي ذكرت في هذه الدراسة مثالية للرصد بسبب غير اختزاع، والحساسية، والدوران السريع وقتهم، والفعالية من حيث التكلفة. يوفر الفحص الموضحة هنا النتائج في غضون 72 ساعة من استلام العينة، مع معدلات الحد الأدنى الكشف إيجابية كاذبة، مما يسهل اتخاذ قرارات العلاج السريع وتلتف بعض القيود التي واجهت مع الاختبار على أساس النسيج⁴.

لدينا بروتوكول وبيانات توضح نظام اختبار قوية لتحديد المتغيرات الحمض النووي الريبي وفرة منخفضة، فضلا عن إمكانيات الطفرة على أساس الدم الاختبار في الممارسة السريرية. للمرضى الذين لم يكن لديك برنامج تشغيل القابلة للتنفيذ الطفرات السريعة خزعة سائلة المستهدفة التي حددها النهج مثل هذا واحد، وإضافة أوسع المجين والبروتين اختبار من الأنسجة والدم قد توفر معلومات سريرية أوسع دعم تخطيط العلاج.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ونشكر نحن المتعاونين، ستيفن جونز، تشارينجتون نيا، د. ديانا مار، والدكتور سامانثا كوبر من مركز علم الأحياء الرقمية (شركة بيو-راد CA) تصميمها المقايسة الدعم؛ نزار رغيي والدكتور عبدالله عبدالعزيز البقمي (نورجين بيوتك، كندا) للمشورة حاسمة عند تحسين استخراج الحمض النووي الريبي البروتوكول؛ وكامبل شانون وجيف فينستيرير، مارتيلو شانون وسكوت ثورستون انوش جولين للمساعدة في اختبار الاحتياجات ورصد التجارية.

Materials

Ultrapure Distilled Water (DNAse, RNAse Free) (500 mL)	Life Technologies	10977-015	1604071
Ultrapure Distilled Water (DNAse, RNAse Free) (500 mL)	Life Technologies	10977-015	1809353
Nuclease-free water (molecular grade)	Ambion	AM9938	1604071
Nuclease-free water (molecular grade)	Ambion	AM9938	1606077
Phosphate Buffered Saline 1X, Sterile	Amresco	K812-500mL	1446C189
Phosphate Buffered Saline 1X, Sterile – 500 mL	Invitrogen	10010023	1916C092
RNase Zap (Life Tech) (250 mL)	Ambion	AM9780	353952
Beta-Mercaptoethanol (BME) (250 mL)	CalbioChem	6050	W105B
OmniPur Ethyl Alcohol	CalbioChem	4455-4L	56054611
OmniPur Ethyl Alcohol	CalbioChem	4455-4L	56238638
Isopropyl Alcohol	VWR	0918-4L	2116C416
TranscriptAid T7 High Yield Transcription Kit	Thermo Scientific	K0441	403648
TranscriptAid T7 High Yield Transcription Kit	Thermo Scientific	K0441	288461
DNase I	Thermo	K0441	371299
QIAzol Lysis Reagent	Qiagen	79306	54809699
20x TE buffer pH 8.0	Alfa Aesar	J62388	R13C548
UltraPure Agarose	Invitrogen	16500-100	552730
10x TBE buffer	Invitrogen	AM9863	353065
Cell-Free RNA BCT	Streck	218976	60110327
Cell-Free RNA BCT	Streck	218976	61900327
Cell-Free RNA BCT	Streck	218976	61480327
Cell-Free RNA BCT	Streck	218976	62320327
Plasma/Serum Circulating and Exosomal RNA Purification Kit (Slurry Format) 50 preps	Norgen	42800	585849
Plasma/Serum Circulating and Exosomal RNA Purification Kit (Slurry Format) 50 preps	Norgen	42800	588308
Lysis Buffer	Norgen	21205	A5F61E
RNA Cleanup and Concentration Micro-Elute Kit (Norgen) 50 preps	Norgen	61000	585848
RNA Cleanup and Concentration Micro-Elute Kit (Norgen) 50 preps	Norgen	61000	588309
DNA Clean and ConcentratorTM- 5 200 preps (samples)	Zymo	D4014	ZRC186976
DNA Clean and ConcentratorTM- 5 200 preps (samples)	Zymo	D4014	ZRC188077
DNA Clean and ConcentratorTM- 5 200 preps (samples)	Zymo	D4014	ZRC188413
Collection Tubes 500 pack	Zymo	C1001-500	N/A
SuperScript IV First Strand Synthesis System 200 rxn (samples)	Life Technologies	18091200	391657
SuperScript IV First Strand Synthesis System 200 rxn (samples)	Life Technologies	18091200	392504
SuperScript IV First Strand Synthesis System 200 rxn (samples)	Life Technologies	18091200	448001
SuperScript IV Reverse Transcriptase	Life Technologies	18090200	451702
Qubit HS RNA Assay Kit (500)	Life Technologies	Q32854	1745264
Qubit assay tubes (500)	Life Technologies	Q32856	13416Q311
ddPCR Supermix for Probes (no dUTP)	Bio-Rad	1863023	64031651
ddPCR Supermix for Probes (no dUTP)	Bio-Rad	1863023	64063941
ddPCR Supermix for Probes (no dUTP)	Bio-Rad	1863023	64065740
ddPCR Supermix for Probes (no dUTP)	Bio-Rad	1863023	64065741
ddPCR Supermix for Probes (no dUTP)	Bio-Rad	1863023	64079083
ddPCR Buffer Control for Probes	Bio-Rad	1863052	64025320
ddPCR Buffer Control for Probes	Bio-Rad	1863052	64052358
gBlock KIF5B-RET K15:R12	IDT	151004172	4-Oct-16
gBlock KIF5B-RET K16:R12	IDT	151004173	4-Oct-16
gBlock KIF5B-RET K22:R12	IDT	151004174	4-Oct-16
gBlock KIF5B-RET K23:R12	IDT	151004175	4-Oct-16
gBlock KIF5B-RET K24:R11	IDT	151004176	4-Oct-16
gBlock KIF5B-RET K24:R8	IDT	151004177	4-Oct-16
gBlock CCDC6-RET C1:R12	IDT	151004178	4-Oct-16
gBlock TRIM33-RET T14:R12	IDT	151004179	4-Oct-16
RET exon 8 RT Gene Specific Primer	IDT	150554385	28-Sep-16
5’-CTCCACTCACACCTG-3’	IDT	150554385	28-Sep-16
RET exon 11 RT Gene Specific Primer	IDT	150554384	28-Sep-16
5’-GCAAACTTGTGGTAGCAG-3’	IDT	150554384	28-Sep-16
RET exon 12 RT Gene Specific Primer	IDT	150554383	28-Sep-16
5’-CTGCCTTTCAGATGGAAG-3’	IDT	150554383	28-Sep-16
gBlock CD74-ROS1 C6:R34	IDT	152324366	15-Nov-16
gBlock CD74-ROS1 C6:R32	IDT	152324367	15-Nov-16
gBlock SDC4-ROS1 S2:R32	IDT	152324368	15-Nov-16
gBlock SDC4-ROS1 S2:R34	IDT	152324369	15-Nov-16
gBlock S13del2046-ROS1 S13del2046:R32	IDT	152324370	15-Nov-16
gBlock S13del2046-ROS1 S13del2046:R34	IDT	152324371	15-Nov-16
gBlock EZR-ROS1 E10:R34	IDT	152324372	15-Nov-16
gBlock TPM3-ROS1 T8:R35	IDT	152324373	15-Nov-16
ROS1 exon 34 RT Gene Specific Primer	IDT	152704983	21-Nov-16
5’-CCTTCCTTGGCACTTT-3’	IDT	152704983	21-Nov-16
ROS1 exon 35 RT Gene Specific Primer	IDT	152704985	21-Nov-16
5’-CTCTTGGGTTGGAAGAGTATG-3’	IDT	152704985	21-Nov-16
ALK Gene Specific Primer	IDT	140035422	26-Aug-16
5’-CAGTAGTTGGGGTTGTAGTCG-3’	IDT	140035422	26-Aug-16
EML4-ALK Cell line pellet	Horizon Discovery	N/A	11-Jun-15
SLC34A2-ROS1 Cell line pellet	Horizon Discovery	N/A	11-Jun-15
CCDC6-RET Cell line pellet	Horizon Discovery	N/A	11-Jun-15
Human Brain Total RNA	Ambion	AM7962	1703548
PrimePCR ddPCR Expert Design Assay: K15:R12	Bio-Rad	N/A	17-Aug-16
PrimePCR ddPCR Expert Design Assay: K16:R12	Bio-Rad	N/A	17-Aug-16
PrimePCR ddPCR Expert Design Assay: K22:R12	Bio-Rad	N/A	17-Aug-16
PrimePCR ddPCR Expert Design Assay: K23:R12	Bio-Rad	N/A	17-Aug-16
PrimePCR ddPCR Expert Design Assay: K24:R11	Bio-Rad	N/A	17-Aug-16
PrimePCR ddPCR Expert Design Assay: K24:R8	Bio-Rad	N/A	17-Aug-16
PrimePCR ddPCR Expert Design Assay: C1:R12	Bio-Rad	N/A	17-Aug-16
PrimePCR ddPCR Expert Design Assay: T14:R12	Bio-Rad	N/A	17-Aug-16
PrimePCR ddPCR Expert Design Assay: C6:R34	Bio-Rad /Biodesix	N/A	6-Dec-16
PrimePCR ddPCR Expert Design Assay: C6:R32	Bio-Rad /Biodesix	N/A	6-Dec-16
PrimePCR ddPCR Expert Design Assay: S2:R32	Bio-Rad /Biodesix	N/A	6-Dec-16
PrimePCR ddPCR Expert Design Assay: S2:R34	Bio-Rad /Biodesix	N/A	6-Dec-16
PrimePCR ddPCR Expert Design Assay: S13del2046:R32	Bio-Rad /Biodesix	N/A	6-Dec-16
PrimePCR ddPCR Expert Design Assay: S13del2046:R34	Bio-Rad /Biodesix	N/A	6-Dec-16
PrimePCR ddPCR Expert Design Assay: E10:R34	Bio-Rad /Biodesix	N/A	6-Dec-16
PrimePCR ddPCR Expert Design Assay: T8:R35	Bio-Rad /Biodesix	N/A	6-Dec-16
(version 2)	Bio-Rad	12003909	213939881
PrimePCR ddPCR Expert Design Assay: ROS1 Multiplex (version 3.2)	Bio-Rad	N/A	13-Dec-16
PrimePCR ddPCR Expert Design Assay: ROS1 Multiplex (version 3.2)	Bio-Rad	N/A	20170112v3.2
PrimePCR ddPCR Gene Expression Probe Assay: GUSB, Human	Bio-Rad	10031257	212851151
PrimePCR ddPCR Gene Expression Probe Assay: GUSB, Human	Bio-Rad	10031257	207383915
PrimePCR ddPCR Gene Expression Probe Assay: GUSB, Human	Bio-Rad	10031257	195995635
PrimePCR ddPCR Gene Expression Probe Assay: GUSB, Human	Bio-Rad	10031257	212851152
PrimePCR ddPCR Gene Expression Probe Assay: GUSB, Human	Bio-Rad	10031257	213949301
PrimePCR ddPCR Expert Design Assay: EML4-ALK	Bio-Rad	12003909	20160914
PrimePCR ddPCR Expert Design Assay: EML4-ALK	Bio-Rad	12003909	211383227
Droplet Generation Oil for Probes	Bio-Rad	186-3005	1065C220
Droplet Generation Oil for Probes	Bio-Rad	186-3005	64052953
Droplet Generation Oil for Probes	Bio-Rad	186-3005	64052358
Automated Droplet Generation Oil for Probes (20×96)	Bio-Rad	186-4110	1065C320
Automated Droplet Generation Oil for Probes (20×96)	Bio-Rad	186-4110	64052952
Automated Droplet Generation Oil for Probes (20×96)	Bio-Rad	186-4110	64064127
DG8 Cartridges for QX100/QX200 Droplet Generator	Bio-Rad	186-4008	C000065883
DG8 Cartridges for QX100/QX200 Droplet Generator	Bio-Rad	186-4008	C000084276
DG8 Cartridges for QX100/QX200 Droplet Generator	Bio-Rad	186-4008	C000079928
DG8 Cartridges for QX100/QX200 Droplet Generator	Bio-Rad	186-4008	C000084395
DG8 Cartridges for QX100/QX200 Droplet Generator	Bio-Rad	186-4008	C000084634
Droplet Generator DG8 Gasket	Bio-Rad	186-3009	20160627
Droplet Generator DG8 Gasket	Bio-Rad	186-3009	20161107
Droplet Generator DG8 Gasket	Bio-Rad	186-3009	20161206
Droplet Generator DG8 Gasket	Bio-Rad	186-3009	20161216
Droplet Generator DG8 Gasket	Bio-Rad	186-3009	20170125
Pipet Tips for Automated Droplet Generator	Bio-Rad	1864120	PR125340
DG32 Cartridge for Automated Droplet Generator (10-96 well plates)	Bio-Rad	186-4108	206894
DG32 Cartridge for Automated Droplet Generator (10-96 well plates)	Bio-Rad	186-4108	206893
Pierceable Foil Heat Seal	Bio-Rad	1814040	1409850
Pierceable Foil Heat Seal	Bio-Rad	1814040	100402
Pierceable Foil Heat Seal	Bio-Rad	1814040	145851
Microseal 'B' seals	Bio-Rad	MSB1001	BR00428490
ddPCR Droplet Reader Oil	Bio-Rad	186-3004	64039089
ddPCR Droplet Reader Oil	Bio-Rad	186-3004	64049253
ddPCR Droplet Reader Oil	Bio-Rad	186-3004	64049255
ddPCR Droplet Reader Oil	Bio-Rad	186-3004	64081870
DNA Lo Bind Tube 0.5 mL	Eppendorf	22431005	E1629620
DNA Lo Bind Tube 1.5 mL	Eppendorf	22431021	F16698K
DNA Lo Bind Tube 2 mL	Eppendorf	22431048	E160610I
50 mL Conicals, Polypropylene (25)	Thermo	339652	G5ZF5W8118
TempAssure PCR 8-Strips, Optical Caps, Natural, polypropylene (120)	USA Scientific	1402-4700	16202
For Rainin LTS Pipettors 0.5-20 µL tips	Pipette.com	LF-20	40155-642C4-642C
For Rainin LTS Pipettors 5-200 µL tips	Pipette.com	LF-250	40154-642C4-642B
Tips LTS 200 ul Filter 960/10 RT-L200F (10 boxes)	Rainin	17002927	1635
Pipet Tips, 10 ul TipOne RPT ultra low retention filter tip refill cassette, sterile	USA Scientific	1181-3710	F1175551-1108
Pipet Tips, 10 ul TipOne RPT ultra low retention filter tip refill cassette, sterile	USA Scientific	1181-3710	F118054L-1720
Pipet Tips, 100 ul TipOne RPT ultra low retention filter tip refill cassette, sterile (10×96)	USA Scientific	1180-1740	0014961Q-2501
Pipet Tips, 200 ul TipOne RPT ultra low retention filter tip refill cassette, sterile	USA Scientific	1180-8710	E116684P-1540
Pipet Tips, 1000 ul XL TipOne RPT ultra low retention filter tip refill cassette, sterile (10×96)	USA Scientific	1182-1730	F118815P
5 mL Standard Racked Gilson-fit Reference Tips	Scientific Specialties	4411-00	14312
Combitips advanced, 0.1 mL Biopur	Eppendorf	003 008 9618	F165414H
Combitips advanced, 0.2 mL Biopur	Eppendorf	0030 089.626	F166689J
Combitips advanced, 5 mL Biopur	Eppendorf	0030.089 669	F166054J
Combitips advanced, 50 mL Biopur	Eppendorf	003.008.9693	F166055I
Reagent Reservoir	VWR	89094-680	141500
Twin tec PCR Plate 96, semi-skirted, Clear	Eppendorf	951020303	E163697P
Twin tec PCR Plate 96, semi-skirted, Clear	Eppendorf	951020303	F165029I
Twin tec PCR Plate 96, semi-skirted, Clear	Eppendorf	951020303	F165028G
Twin tec PCR Plate 96, semi-skirted, Clear	Eppendorf	951020303	E163697P
Twin tec PCR Plate 96, semi-skirted, Green	Eppendorf	951020346	F166183K
Equipment Type		Equipment ID
Analytical Balance		EQP0125
Cryogenic Freezer 1, -80^oC		EQP0095
Refrigerator 6.1 cu ft GP06W1AREF		EQP0139
-20^oC Freezer		EQP0140
Beckman Coulter Microfuge 22R		EQP0025
Beckman Coulter Microfuge 22R		EQP0124
Thermo Scientific Hereaus Megafuge 8		EQP0104
Mini Centrifuge		EQP0131
Mini Centrifuge		EQP0136
Mini Centrifuge		EQP0134
Mini Centrifuge		EQP0235
Mini Centrifuge		EQP0216
Thermo Scientific HeraTherm Incubator		EQP0105
Pipette 0.1 – 2.5 μL		EQP0182
Pipette 0.1 – 2.5 μL		EQP0072
Pipette 0.1 – 2.5 μL		EQP0070
Pipette 0.5-10 μL		EQP0218
Pipette 0.5-10 μL		EQP0075
Pipette 0.5-10 μL		EQP0169
Pipette 0.5-10 μL		EQP0074
Pipette 0.5-10 μL		EQP0147
Pipette 2 – 20 μL		EQP0128
Pipette 2 – 20 μL		EQP0160
Pipette 2 – 20 μL		EQP0018
Pipette 2 – 20 μL		EQP0146
Pipette 10 – 100 μL		EQP0079
Pipette 10 – 100 μL		EQP0181
Pipette 10 – 100 μL		EQP0085
Pipette 10 – 100 μL		EQP0077
Pipette 20 – 200 μL		EQP0088
Pipette 20 – 200 μL		EQP0087
Pipette 20 – 200 μL		EQP0231
Pipette 100 – 1000 μL		EQP0050
Pipette 100 – 1000 μL		EQP0158
Pipette 100 – 1000 μL		EQP0217
Pipette 100 – 1000 μL		EQP0082
Pipette 100 – 1000 μL		EQP0183
Pipette 100 – 1000 μL		EQP0083
Pipette 5 mL		EQP0153
Timer		S/N 140623950
Hamilton SafeAire VAV Fume Hood		EQP0206
Biosafety Cabinet		EQP0205
Biosafety Cabinet		EQP0204
Qubit 3.0		EQP0102
Benchmark Digital Heat Block		EQP0108
Benchmark Digital Heat Block		EQP0231
Polaroid Z2300 Instant Print Digital Gel Camera with WiFi and 16GB SDHC memory card		EQP0111
Electrophoresis Power Unit		EQP0113
Electrophoresis Small Gel Box		EQP0116
Maestro Transilluminator		EQP0118
Microwave		EQP0215
Multichannel 8-well Pipette 2 - 20 μL		EQP0207
Multichannel 8-well Pipette 10 – 100 μL		EQP0090
Rainin Multichannel 8-well Pipette 50 μL		EQP0094
Rainin Multichannel 8-well Pipette 50 μL		EQP0161
Rainin Multichannel 8-well Pipette 50 μL		EQP0162
Rainin Multichannel 8-well Pipette 50 μL		EQP0163
Vortex Genie 2		EQP0052
Vortex Genie 2		EQP0007
Vortex Genie 2		EQP0132
Vortex Genie 2		EQP0137
Vortex Genie 2		EQP0135
Air Clean PCR Workstation		EQP0203
Air Clean PCR Workstation		EQP0096
Air Clean PCR Workstation		EQP0148
Air Clean PCR Workstation		EQP0097
QX200 Droplet Generator		EQP0202
QX200 Droplet Generator		EQP0121
Automated Droplet Generator		EQP0179
PX1 PCR Plate Sealer		EQP0123
PX1 PCR Plate Sealer		EQP0186
C1000 Touch Cycler w/96W FS RM		EQP0120
S1000 Cycler w/96W FS RM		EQP0174
S1000 Cycler w/96W FS RM		EQP0173
T100 Thermal Cycler		EQP0180
T100 Thermal Cycler		EQP0175
QX200 Droplet Reader		EQP0194
QX200 Droplet Reader		EQP0122

References

Ignatiadis, M., Lee, M., Jeffrey, S. S. Circulating Tumor Cells and Circulating Tumor DNA: Challenges and Opportunities on the Path to Clinical Utility. Clin Cancer Res. 21 (21), 4786-4800 (2015).
Alix-Panabieres, C., Pantel, K. Clinical Applications of Circulating Tumor Cells and Circulating Tumor DNA as Liquid Biopsy. Cancer Discov. , (2016).
Paxton, A. Is Molecular AP testing in sync with guidelines. CAP Today. , (2014).
Sacher, A. G., et al. Prospective Validation of Rapid Plasma Genotyping for the Detection of EGFR and KRAS Mutations in Advanced Lung Cancer. JAMA Oncol. , (2016).
Sozzi, G., et al. Quantification of free circulating DNA as a diagnostic marker in lung cancer. J Clin Oncol. 21 (21), 3902-3908 (2003).
Oxnard, G. R., et al. Noninvasive detection of response and resistance in EGFR-mutant lung cancer using quantitative next-generation genotyping of cell-free plasma DNA. Clin Cancer Res. 20 (6), 1698-1705 (2014).
Best, M. G., et al. RNA-Seq of Tumor-Educated Platelets Enables Blood-Based Pan-Cancer, Multiclass, and Molecular Pathway Cancer Diagnostics. Cancer Cell. 28 (5), 666-676 (2015).
Rodriguez, M., et al. Different exosome cargo from plasma/bronchoalveolar lavage in non-small-cell lung cancer. Genes Chromosomes Cancer. 53 (9), 713-724 (2014).
Kalluri, R. The biology and function of exosomes in cancer. J Clin Invest. 126 (4), 1208-1215 (2016).
Mellert, H., et al. Development and Clinical Utility of a Blood-Based Test Service for the Rapid Identification of Actionable Mutations in Non-Small Cell Lung Carcinoma. J Mol Diagn. 19 (3), 404-416 (2017).
Qin, J., Williams, T. L., Fernando, M. R. A novel blood collection device stabilizes cell-free RNA in blood during sample shipping and storage. BMC Res Notes. 6, 380 (2013).
Chomczynski, P. A reagent for the single-step simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from cell and tissue samples. Biotechniques. 15 (3), 532-537 (1993).
Kohno, T., et al. Beyond ALK-RET, ROS1 and other oncogene fusions in lung cancer. Transl Lung Cancer Res. 4 (2), 156-164 (2015).
Takeuchi, K., et al. ROS1 and ALK fusions in lung cancer. Nat Med. 18 (3), 378-381 (2012).
Rimkunas, V. M., et al. Analysis of receptor tyrosine kinase ROS1-positive tumors in non-small cell lung cancer: identification of a FIG-ROS1 fusion. Clin Cancer Res. 18 (16), 4449-4457 (2012).
Tsuta, K., et al. RET-rearranged non-small-cell lung carcinoma: a clinicopathological and molecular analysis. Br J Cancer. 110 (6), 1571-1578 (2014).
Forbes, S. A., et al. COSMIC: somatic cancer genetics at high-resolution. Nucleic Acids Res. 45 (1), 777-783 (2017).
Salgia, R. Diagnostic challenges in non-small-cell lung cancer: an integrated medicine approach. Future Oncol. 11 (3), 489-500 (2015).
Cagle, P. T., Raparia, K., Portier, B. P. Emerging Biomarkers in Personalized Therapy of Lung Cancer. Adv Exp Med Biol. 890, 25-36 (2016).
Vogelstein, B., Kinzler, K. W. Digital PCR. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (16), 9236-9241 (1999).
Oxnard, G. R., et al. Association Between Plasma Genotyping and Outcomes of Treatment With Osimertinib (AZD9291) in Advanced Non-Small-Cell Lung Cancer. J Clin Oncol. 34 (28), 3375-3382 (2016).
Reckamp, K. L., et al. A Highly Sensitive and Quantitative Test Platform for Detection of NSCLC EGFR Mutations in Urine and Plasma. J Thorac Oncol. 11 (10), 1690-1700 (2016).
Yanagita, M., et al. A prospective evaluation of circulating tumor cells and cell-free DNA in EGFR mutant non-small cell lung cancer patients treated with erlotinib on a phase II trial. Clin Cancer Res. , (2016).
Abbosh, C., et al. Phylogenetic ctDNA analysis depicts early-stage lung cancer evolution. Nature. 545 (7655), 446-451 (2017).
Chomczynski, P. A reagent for the single-step simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from cell and tissue samples. BioTechniques. 15 (3), 532-534 (1993).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Mellert, H. S., Alexander, K. E., Jackson, L. P., Pestano, G. A. A Blood-based Test for the Detection of ROS1 and RET Fusion Transcripts from Circulating Ribonucleic Acid Using Digital Polymerase Chain Reaction. J. Vis. Exp. (134), e57079, doi:10.3791/57079 (2018).

Automatically Generated

الدم على أساس اختبار للكشف عن ROS1 و RET المستنسخات الانصهار من تعميم الحمض النووي الريبي استخدام الرقمية تفاعل البوليميراز المتسلسل

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Tags

Play Video

Cite This Article

View Video

Automatically Generated

الدم على أساس اختبار للكشف عن ROS1 و RET المستنسخات الانصهار من تعميم الحمض النووي الريبي استخدام الرقمية تفاعل البوليميراز المتسلسل

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Tags

Play Video

Cite This Article

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below