JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Medicine

Kan tabanlı Test ROS1 tespiti için ve füzyon transkriptleri ribonükleik asit veya dijital Polimeraz zincir reaksiyonu kullanarak dolaşan gelen RET

Published: April 05, 2018
doi:
10.3791/57079
, , ,
1Biodesix

Summary

Algılama ribonükleik asit (cRNA) kan dolaşan bir karşılanmamış ihtiyaç Klinik teşhis olduğunu. Burada küçük hücreli dışı akciğer kanserli hastalarda hassas ve belirli dijital Polimeraz zincir reaksiyonu kullanarak üzerinden cRNA karakterize yöntemleri açıklanmaktadır. Testleri 72 saat içinde füzyon türevlerini algılamak için tasarım gereksinimlerini karşılamak.

Abstract

Yalıtım ve tümör kaynaklı dolaşımdaki ribonükleik asit (cRNA) sıvı biyopsisi kan tabanlı için karakterizasyonu için yeni yöntemler geliştirdik. CRNA kandan kurtarılan sağlam tespiti bir kritik karşılanmamış ihtiyaç Klinik teşhis için bir çözüm temsil eder. Test tam kan koleksiyonuna cRNA stabilize koruyucu madde içeren kan toplama tüpler ile başlar. Boş hücre, exosomal ve trombosit ilişkili RNA plazma izole bu test sistemi. CRNA Tamamlayıcı DNA (cDNA) transkripsiyonu ve dijital Polimeraz zincir reaksiyonu (dPCR) kullanılarak güçlendirilmiş ters. Örnekleri hem hedef biyomarker yanı sıra için bir denetim gen değerlendirilir. Test doğrulama algılama, doğruluk ve sağlamlık çalışmalar analitik örnekleri ile sınırı dahil. Tekrarlanarak bu çalışmalar sonucunda geliştirilen yöntem ROS1 için birden fazla füzyon türevlerini algılamak (C-Ros proto-oncogene 1; 8 türevleri) ve RET (transfection proto-oncogene sırasında; yeniden düzenlenmiş 8 türevleri). Böylece test sonuçlarını sürekli örnek alındığı 72 saat içinde oluşturulabilir örnek işleme iş akışı optimize edilmiştir.

Introduction

Kadar küçük hücreli dışı akciğer kanseri (NSCLC) yüzde 25 hasta yeterli doku tanı anda test için hazır olabilir. Doku kullanılabilir olduğu durumlarda bile bu yeterli miktar veya gerçekleştirmek için kalite moleküler testler1,2tavsiye edilebilir değil. Durumlarda moleküler profil oluşturma için biyopsi yeterli doku olduğu hastalar birkaç hafta veya daha uzun sonuçlarını beklemek veya tedavi moleküler sonuçları3,4olmadan başlamak zorunda kalabilirsiniz. Ancak, bu hastaların NSCLC ile tanısı için birden çok hedefli tedavi seçenekleri gelişiyle verilen bilgilendirici moleküler tanı kullanılabilir olması önemlidir. Dolaşımdaki boş hücre DNA’ın (cfDNA) sıvı biyopsi üzerinden test geleneksel doku4,5,6test zorlukların bir çözümdür. Dava cfDNA ve benzer bir dPCR tabanlı iş akışı hızlı sonuç oluşturmak için kullanarak NSCLC mutasyonların geçerli test seçenekleri içerir mutasyonlar ΔE746-A750 ve L858R, EGFR direnci mutasyon T790M duyarlılığı epidermal büyüme faktörü reseptörü (EGFR) , KRAS Proto-Oncogene (KRAS) çeşitleri ve B-Raf Proto-Oncogene (BRAF) değişken V600E. Her ne kadar genel olarak alan tarafından kabul edilen değil, mesajcı RNA (mRNA) tümör elde edilen sıvı biyopsi izole dolaşan önemli klinik bilgiler7,8,9da sağlayabilir. Biz daha önce geliştirilen ve Echinoderm Mikrotubul Protein gibi ilişkili 4 Anaplastik lenfoma reseptör tirozin kinaz (EML4-ALK) füzyon varyantları kan plazması10çoğaltılmış algılama yöntemleri bildirdi. Bu çalışmada, ROS1 ve RET, sekiz füzyon türevleri her tahlil içinde kapsayan için üst düzey çoğaltılmış RNA hedefler dahil etmek için bu yöntemleri genişletilmiş. Amaç bu füzyon çeşitleri gelen hastaların daha önce NSCLC ile tanısı plazma tespiti için hızlı, hassas, belirli ve tekrarlanabilir bir teknik geliştirmekti.

Test işlemi içinde bir hekim ofisi RNA kan toplama tüpler11sabitleme kullanarak başlatılır. Bu tüpler RNase inhibitörleri hem de koruyucu bir hücre içerir. Gecede Merkezi Amerikan patologlar kap kolej akredite/klinik laboratuvar iyileştirme değişiklikler (CLIA) için sevk öncelikli olduğu-sertifikalı laboratuvar (klinik laboratuvar) yetkili personel tarafından işleme için. Klinik laboratuvar tarafından alınan sonra her adım işleme onaylanmış standart işletim yordamlar (SOP) altında yapılır. Tam kan plazma, daha sonra ya da RNA dolaşan yalıtmak için kullanılır kurtarmak için centrifuged kan ya da moieties, exosomes ve trombosit7,8,9gibi Kapsüllenen içinde serbest. Bu bölmeleri gelen RNA yalıtmak için sistem üzerinde birkaç çıkarma yöntemleri karşılaştırmalarına göre RNA kurtarma için seçili. İzole RNA transkripsiyonu cDNA için konsantre ve geriye doğru. Birkaç transkriptaz enzim ve gen özgü astar cDNA sentez yöntemi hedef transkript dönüşüm10ROS1 ve RET en üst düzeye çıkarmak için en iyileştirme sırasında değerlendirildi. Bu Tutanaklar, tümör kaynaklı füzyon türevleri gibi dolaşan düşük bereket için önemlidir. Son olarak, dPCR astar ve yoklama konsantrasyonları RET veya ROS1 füzyon türevleri ve denetim gene, glucuronidase-β (GUSB) çoğaltılmış tespiti için izin vermek için optimize edilmiştir. Biz o zaman son kilitli protokolü bu raporda açıklanan analitik doğrulama çalışmaları yapmadan önce en iyi koşulları her optimizasyon çalışmaları kombine. Bu iletişim kuralı ve bu sonuçlar nadir füzyon türevleri dolaşımda rutin tespiti için hızlı ve hassas bir iş akışı için temel sağlar.

Protocol

Üreticilerin yönergeleri için aşağıda listelenen reaktifler aksi belirtilmedikçe sürece takip edilmektedir. PCR deneyleri piyasada bulunan ürünler ROS1 ve RET füzyon algılamak için tasarlanmış bulunmaktadır. 1. çalışma ile ters transkripsiyon (RT) için hazırlık RNA-dPCR: Laboratuvar en iyi yöntemler RNA ile çalışırken RNase içermeyen bir ortam oluşturun. Piyasada bulunan spreyler bulaşıcı RNases devre dışı bırakabilirsiniz için tasarlanmış kullanın. Kullanım RNase free reaktifler, ipuçları ve tüpler sertifikalı. RNases getirilmesi veya çapraz bulaşma örneklerinin önlemek için bariyer ipuçları için pipettors kullanın. Her zaman tanecikleri örneğinizi giydirilmiş düşmesini önlemek için bir laboratuvar önlüğü giyiyorsun. RNA işlenmesi ile kullanmak için bir laboratuvar kat özel belirleyin. RNases örnek kirlenme cilt önlemek için eldiven giymek. Eldiven sık sık değiştirin.Not: Ortama maruz kalır bu yana laboratuvar yüzeyler RNase ile kontamine varsayıyorum. Cilt, saç, kapı tokmakları, dondurucu kolları, kalemler/işaretleri, vb temas eldivenler artık RNase free olarak kabul edilir. Pipettors, benchtops, santrifüj ve diğer çalışma yüzeyleri kullanın RNase inactivation sprey önce bir ile dezenfekte etmek. Mümkünse, ekipman sadece RNA kullanılmak üzere bir dizi korumak. Laboratuvar alanlarda hava akımı kesintiye uğraması örnekleri düşen veya çalışma alanının kirletici partiküller önlemek için RNA örnekleri ile çalışırken en aza indirmek. Mağaza RNA-80 ˚C saf. Bu bozulma neden olabilir RNA örneklerinin birden çok donma thaws önlemek. 2. nesil olumlu denetimleri için analitik RNA malzeme Sentetik DNA faiz10füzyon türevleri için yayımlanmış mRNA dizileri kullanarak tasarlayın. Verilen füzyon varyant için fusion sitesinde artı yeterli uzunlukta PCR amplicon karşılamak için her iki tarafta kanat içerir bir mRNA füzyon serisi seçin. Nükleotit dizileri arasında 50-250 nt trombosit zenginleştirilmiş plazma ile yakalanan RNA dolaşan boyutta taklit etmek için seçin. T7 organizatörü sıra Ekle (5′-CAGAGATGCATAATACGACTCACTATAGGGAGA-3′) 5′ uç hedef sırasının için. Çift telli deoksiribonükleik asit (DNA) parçaları da sentetik dizileri sipariş. Tris-EDTA (TE) arabelleği 10 ng/µL son bir konsantrasyon için sentetik DNA sulandırmak. 60 ng sentetik DNA RNA vitro transkripsiyon kullanarak dönüştürmek. Fenol/guanidin tabanlı reaktif12kullanarak RNA transkript arındırmak. Dnaz dahil ben RNase kalan şablon DNA kaldırmak için ücretsiz. Arıtılmış vitro RNA özel boyalar ve standartları ile piyasada bulunan bir yer kullanma RNA konsantrasyon ölçmek. RNA için seçilen standartlar kabul edilebilir aralık içinde olduğundan emin olun. Seyreltme gerekli olabilir. Başarılı transkripsiyonu RNA jel leke ve yüksek aralığı 50-250 nt boyutu aralığı da dahil olmak üzere RNA merdiven ile karıştırılarak % 2 özel jel kullanarak Jel Elektroforez ile onaylayın. Her vitro RNA bir jel üzerine yük 500 ng. Jel 5 V/cm çalıştırın. Tek grup aydınlatma kullanarak görselleştirmek ve sonuçları belge. Her biri (Adım 2.1.2 tasarımında temel) füzyon türevleri için beklenen transkript boyutunu doğrulayın. Her vitro RNA RT-dPCR eşleşen değişken özgü PCR tahlil kullanarak tarafından algılanmasını onaylamak (bkz: adım 5-8 Bu protokol). İsteğe bağlı: vitro RNA her füzyon türevleri ve denetim gen GUSB içeren bir ekimolar karışım hazırlayın. Adım 2,9 gerçekleştirilirse: algılama her varyant özgü PCR deneyleri (bkz: adım 5-8 Bu protokol) kullanarak dPCR tarafından kontrol karışımı dahil füzyon versiyonlarının onaylayın. İstenen giriş konsantrasyonu analitik olumlu denetimler için 0,25 2.5 fg10′ a kadar konsantrasyonları sınayarak belirlemek. İstenen kopya numarası çıktısı üzerinde dayalı konsantrasyon seçin. Onay 10 µL tek kullanımlık aliquots analitik RNA’ın olumlu denetim (Adım 4.4) ve-80 ˚C dükkanında kullanmak için hazır olun. 3. donör numuneler RNA boş hücre koruyucu madde içeren 10 mL insan tam kan örnekleri 10 mL kan toplama tüpler (BCT) toplamak.Not: Tüm insan bağış kullanım araştırma için izin ve donör özgü tanıtıcı bilgi toplanan veya sınama sırasında kullandığı. Tam kan örnekleri BCT üreticisi tarafından belirtilen süre içinde işlem. Havuza alınan normal insan plazma analitik olumlu denetim içinde kullanılmak üzere ticari bir kaynaktan satın alınabilir. Tek kullanımlık, 1 mL aliquots havuza alınan normal insan plazma ve-80 ˚C mağazasında olumlu denetim (Adım 4.4) ile kullanmak için hazır olun. 4. kurtarma RNA plazma üzerinden dolaşan Not: Bu yordam sırasında hızlı bir şekilde çalışmak önemlidir. 200 x g 20 dk için de tam kan tüpler santrifüj kapasitesi. İlâ 4 mL plazma serolojik pipet kullanarak centrifuged kan toplama tüpünden toplamak. Rahatsız ya da buffy kat tabaka Aspire edin değil dikkatli olun. Dolaşımdaki RNA exosomes, trombosit ve boş hücre RNA plazma üzerinden yakalayabilir piyasada bulunan bir seti kullanarak yalıtmak. Her toplu iş iş yanında olumlu denetim örnekten RNA yalıtmak. Pozitif kontrol klinik örnekleri her toplu işlem için aşağıdaki şekilde hazırlayın: 1 havuzlu mL normal insan plazma aliquot (Adım 3.3) çözülme. 10 µL analitik RNA aliquot (Adım 2.12) çözülme. Pozitif kontrol etanol lysate plazma eklendikten sonra 10 µL analitik RNA normal insan plazma örnek ekleyerek hazırlayın. Örnekleri 100 µL nükleaz ücretsiz su ile elute. Hemen RNA ile temizlemek devam ve konsantrasyon. Örnekleri ıslak buz üzerinde depolanabilir ve kapalı, bir saat kadar. Sütun tabanlı yöntemi kullanma RNA konsantre ve su RNase free 9 µL içinde elute. Derhal adım 5’e gidin veya örnekleri ıslak buz üzerinde bir saat kadar tutun. 5. cDNA için RNA’ın ters transkripsiyon Konsantre dolaşımdaki RNA örnek cDNA rasgele astar (bkz. Tablo 1 için bileşenleri) gibi bir ticari olarak mevcut ters transkripsiyon tepki kit kullanarak dönüştürmek.Not: Gene belirli astar isteğe bağlıdır ve test türevleri için tasarlanabilir. Astar dayalı hedef RNA dizisi olarak tasarlanmıştır. Füzyon varyant sıraları kimden adım 2.1 kullanmak. Ters transkriptaz denetim örnek yok ve hiçbir RNA denetimi örneğini içerir (bkz. Tablo 1). CDNA piyasada bulunan bir DNA yoğunlaştırıcı spin sütun kullanarak ters transkripsiyon reaksiyon gelen izole et.Not: Bu adımı enzimler, astar ve ücretsiz deoxynucleotide trifosfatlardan (dNTPs) kaldırılmasını kolaylaştırır. CDNA hemen PCR reaksiyonları kullanın veya-80 ˚C saklayabilirsiniz. 6. dijital PCR Not: Bu PCR için damlacık belirli dijital PCR (bkz: Malzemeler tablo). PCR karışımı önlemler. Tek kullanımlık laboratuvar mont ve nitril eldiven giymek. Kullanım PCR reaktifler bir adanmış reaktif hazırlık alanda karıştırın. CDNA salt reaktif hazırlık alanında işleyemez. Sonda gelen ışık onları korumaya çalışırken kapsar. Aşırı ışık fotoğraf için sonda bağlı floresan boya çamaşır suyu. Kaplı karışımları, taşıma ve ışıktan, cDNA önce ayrı bir ön amplifikasyon alana eklenecek korumalıdır. Test edilecek cDNA ekle öncesi güçlendirme alanında bulunan PCR karışımı bir PCR temiz Hood. PCR karışımları Tablo 2göre 20 µL son tepki hacmi için hazır olun. Dağıtmak PCR karışımları + cDNA PCR plakaları için.Not: Olarak bir rehber tavsiye bir plaka düzenini kullanın. Bir çıkarılabilir plaka mühürleyen kullanarak plaka kapak. Kısaca kuyu dibinde örnekleri toplamak için tabak santrifüj kapasitesi. 10 için düşük bir ayara üzerinde plaka shaker Mix s. Kısaca Kuyunun dibinde örnek toplamak için tabak santrifüj kapasitesi. Plaka mühürleyen kaldırın. Damlacık üretimi PCR-cDNA karışımı ile ikisinden biri için el ile veya otomatik damlacık üretimi sistemi uygulayın. Manuel damlacık üretimi için 20 µL PCR karışımı örnek wells için damlacık üretimi çıkarma, aktarın. Damlacık üretimi Petrol 70 µL ekleyin. Kauçuk conta ve transfer kartuş damlacık üretimi başlatmak için el ile damlacık jeneratör için kapak. Damlacık üretimi, üretici tarafından önerilen ipuçlarını kullanarak bir taze PCR plaka damlacıkları aktarın. Aspire edin ve damlacıkları yavaş yavaş, 5’e 6 üzerinden dağıtmak s her ucuna kadar damlacık kartuş veya plaka açılışı dokunmadan. Otomatik damlacık üretimi için bir folyo mühür ve damlacık jeneratör transfer ile plaka mühür. Tüm ipuçları, kartuşları, emin olun ve plakaları damlacık üretimi başlamadan önce yerdesiniz. Aşağıdaki damlacık üretimi ve damlacıkları aktarmak taze PCR plaka mühür bir folyo plaka mühürleyen ve Tablo 3′ te ayarlarla termal döngüsü plakaları ile. Termal cycler sonra Çalıştır bir damlacık okuyucu kullanarak plaka okuma tamamlanmıştır. Denetimleri, örnekleri, vb, konumunu tanımlar okuyucu bilgisayar yazılımı için bir plaka düzen oluşturmak ve okumak başlatmak için yazılımı içine yük. 7. veri analizi ve inceleme ve sonuçları nesil Piyasada bulunan yazılım kullanarak sonuçları okumak plaka analiz. İki boyutlu (2D) genlik araziler görüntülemek için analiz menüsüne yönlendirir. Damlacık veri inceleyerek verileri genel kalitesini değerlendirmek. Olaylar menüsünü kullanarak toplam kabul edilen olay numaraları için verileri değerlendirmek. İyi ücret daha az 10,000 olayları ise ek sorunlar için veri dikkatle değerlendirin. Anormal Floresans genlikleri verilerini denetleme. Önemli genlik farklılıkları ve konsantrasyon Çoğalt örnekleri arasındaki farklar zavallı işleme veya örnekleri karıştırma gösteriyor. Sprey desenleri ile damlacık kümelerde kalitesiz damlacıkları ya da sorunlu örnekleri göstergesidir bir 45 derecelik eksen notlar. Pozitif kontrolü, hayır ters transkriptaz (Hayır RT) ve Hayır RNA denetim (NRK) veri önce denetleyin. Tüm kontrol örnekleri seçin ve küme kalite 2D çizim tarafından inceleyin. Uygun eşik için damlacık kümeleri arasında net bir ayrım belirgin olmalıdır. Her tahlil varyant için denetim wells göre eşik ayarlayın. Eğer çift negatif damlacık nüfus kontrolü gen nüfus (5′-hexachloro-floresein-CE phosphoramidite sonda ile etiketli olan), y ekseni ve varyant gen nüfus, ayırt etmek ince artı aracını kullanarak 2D araziler üzerinde küme eşikleri mevcut) floresein amidite ile OR 6-carboxyfluorescein sonda etiketli olan), x ekseni. Toplam Çoğalt her şey tek bir örnek için kopyalar. Test sonuçlarını varyant kopya tespit olarak hızlı.Not: Olumlu ya da olumsuz bir örnek, aradığınız için analitik kesme biçimi değerini belirlemek çalıştırmak için normal bir sağlıklı donör örnek (en az 10 bireysel örnekleri) kesinleşmiş sürecinde ayarla ve kesim herhangi bir tespit arka plan sinyal mutasyon için yukarıda kurmak faiz. Ayrıca, bir pozitif veya negatif sonuç aramak için gerekli denetim Gen kopya sayısını kurmak. Bu denetim gen kesme bir iç kalite kontrol (QC) miktar ve işlenen her RNA örnek kalitesini değerlendirmek için işlev görür. 8. hücre hatları (isteğe bağlı) kullanarak RT-dPCR reaksiyon koşulları doğrulanması Füzyon türevlerini algılama doğrulamak için piyasada bulunan hücre hatları ROS1 veya RET füzyon ifade kullanın mRNA ilgi. Şu adımları izleyin: Flaş donmuş hücrelerinde lizis guanidinium tabanlı dondurulmuş devlet doğrudan çözümden lunaparkçı. Hatta kısa homojenizasyon önce çözdürme RNA bozulması ve kaybına neden olabilir. RNA için tasarlanmış silis-membran spin sütunları kullanarak RNA yalıtmak. Bir yer standartları ve RNA özgü reaktifler kullanarak RNA örnekleri konsantrasyonu ölçmek. Yalıtılmış RNA içine bir arka plan vahşi tipi RNA plazma veya başka bir ticari kaynak oranında seyreltin. CDNA, dijital PCR ve veri analizi ve bir daha gözden geçirme, transkripsiyonu RNA ters gelen adımları gerçekleştirmek ve sonuçları üretimi tespiti istenen değişken onaylamak için bu protokol için listelenen.

Representative Results

Bu iletişim kuralı RNA füzyon türevleri NSCLC hastalar (şekil 1A) plazma içinde sürücü mutasyonlar ölçüm kullanılmak tespiti için geliştirilen bir test sistemi açıklanır. Füzyon mRNA ürünleri NSCLC popülasyonda en yaygın RET ve ROS1 düzenlemeler ifadeden13,14,15,16,17tespit. Çoğaltılmış PCR deneyleri sonra sekiz en yaygın transkript türevleri her hedef için NSCLC içinde tek bir tepki içinde algılamak için tasarlanmıştır. ROS1 odağı, en yaygın translokasyonlar dernekler 5′ bölümleri CD74, SDC4, SLC34A2, EZR veya TPM3 genler (şekil 1B) oluşturur. En yaygın translokasyonlar, RET odağı yan yana ile KIF5B, kendisi için tahlil altı exon kavşaklar kapsar neden. Kapsamında ek RET ortakları ile CCDC6 ve TRIM33 (şekil 1C) içerir. Toplamda, yaklaşık % 88 deneyleri kapak ROS1 ve RET değişiklikler NSCLC hasta17′ gerçekleşmesi için bilinen % 99’u. Tahlil bileşenleri özgüllük ilk ROS1 veya RET tarafından füzyon transkriptleri deneyleri multiplexed için mRNA sıra içeren sekiz bireysel vitro RNA’lar kullanılarak değerlendirilmiştir. Her RNA türler çoğaltılmış sürüm oluşur bireysel her varyant tahlil karşı test edilmiştir. Bu deneyleri yok olan, böylece % 100 gösteren analitik özgüllük içinde tasarlanmış multiplexed deneyleri (veri gösterilmez). Algılama testi Protokolü’nün alt sınırı belirlemek için toplam RNA hücre satır tahlil dahil bir füzyon değişken ifade elde karışık bir arka plan % 5, % 1, % 0,2 ve %0,04 konsantrasyonlarda normal RNA’ın içine. Kadar az % 0,2 füzyon değişken (Şekil 2A-B) olarak tespit çoğaltılmış RET ve ROS1 varyant PCR deneyleri. Buna ek olarak, % 5’lik bir hazırlık kapalı-hedef hücre kültürünü türetilmiş RNA (EML4-ALK füzyon transkript ifade) çoğaltılmış ROS1 ve RET deneyleri ile daha fazla özgüllük (Şekil 2A-B) gösteren algılanmadı. Hassas RT-dPCR süreci test her iki ROS1 için gerçekleştirilmiş ve e. analitik kontrol malzemesi ekimolar vitro RNA’ların oluşan üç konsantrasyonları (yüksek, orta ve düşük) ters transkripsiyon ve dPCR 3’te işlendi farklı durumlar aynı gün (iç-gün), üç gün üst üste (arası gün) ve iki işleç (arası işleç) içinde. Kesinlik testinin sonuçları hem faiz füzyon transkript yanı sıra bir denetim gen, bir iç QC ölçüsünü (şekil 2C-D) bulunan GUSB, doğru algılama gösterdi. GUSB iç kontrol ek olarak, klinik örneklerin her toplu iş iş bir grup toplu iş denetimi çalıştırıldı. Olumlu bir denetim analitik içinde in vitro bir karışımı her RT-dPCR in test füzyon versiyonlarının temsil RNA, hem de analitik vitro RNA GUSB için geliştirilmiştir. Bu RNA normal insan plazma RNA ayıklama sırasında lysate içine arttı ve Protokolü boyunca klinik örneklerin yanında işlendi. Ters transkriptaz (Hayır RT) kontrol RNA ayıklama iş akışı içinde bulaşıcı malzeme yokluğu onaylamak ve astar özgüllük RNA için göstermek için bir negatif kontrol yapıldı. Hayır RT denetim pozitif kontrol olarak aynı malzeme kullanılarak oluşturulan ancak cDNA sentezi tepki içinde enzim içermez. RNA kontrol (NRK) Tutanaklar ters transkripsiyon reaksiyon bileşenleri kirletici yokluğu onaylamak için negatif bir denetimdir. Bu denetim cDNA sentez adımda iş akışı içine tanıtıldı ve su tepki yerine bir RNA şablon olarak eklendi. Hayır RT ve NRK denetimleri doğru sonuçları teslim edilecek ise her iki kanal negatif olması gerekir. Tablo 1 ters transkripsiyon reaksiyon bileşenleri her denetim için listeler. Bu denetimlerin her birinin için 2D araziler örnekleri için ROS1 gösterilir (şekil 3 A-C) ve RET (şekil 3 E-G) multiplex deneyleri. Füzyon türevleri floresein amidite (FAM) sonda kullanarak tespit edildi ve denetim gene, GUSB, 5′-hexachloro-floresein-CE phosphoramidite (ONALTILIK) sonda kullanarak algılandı iken y ekseni gösterilir ve x ekseni üzerinde. Bu toplu işlem denetimleri tahlil sağlamlık belirlemek için 21 gün boyunca değerlendirildi. Füzyon olumlu damlacıkları ve GUSB kontrol gen damlacıkları ROS1 ve RET için çalışma (şekil 3D, H) boyunca yürütülen tüm 21 ishal tespit edildi. Tüm negatif denetimleri (Hayır RT ve NRC) tüm 21 gün (veri gösterilmez) arasında negatif sonuç vermedi. Sorun giderme yeteneği klinik laboratuvar ortamında çalıştırmak için herhangi bir test Protokolü önemli bir bileşenidir. Burada, gerçek dünya örnekleri RT-dPCR iletişim kuralını kullanarak alt-optimal sonuçlarının sağlamak. Ters transkriptaz kontrol (şekil 4A) önemini gösteren bir örnek 2D çizim ilkidir. Bu örnekte, mutant olumlu damlacıkları olmasına rağmen cDNA dönüştürme nedeniyle enzim eksikliğine bağlı mevcuttu. Bu sonucu hedef kapalı genomik DNA yükseltecek dPCR astar nedeniyle büyük olasılıkla oldu. Bu durumda, tasarım bir intron kapsayan testin genomik DNA amplifikasyon engeller. Alternatif olarak, bir RNase free Dnaz enzim bulaşıcı DNA ortadan kaldırmak için kullanılabilir ancak bazı RNA bozulması enzim ile kuluçka sırasında oluşabilir gibi bu nadir hedefleri, tespiti için tavsiye edilmez. Sonraki örnek 2D arsa bir NRK her iki kanal (şekil 4B) pozitif damlacıkları ile oldu. Bu Kirlilik RT-dPCR kurulum aşamasında belirtti. Bu durumda, sınamada kullanılan herhangi bir potansiyel kirlenmiş reaktifler atmak, iyice tüm ekipman arındırılmasına ve taze reaksiyon bileşenleri ile yeniden test için önerilir. Bir sprey 45 ° hattı (şekil 4C) boyunca damlacıkları olarak sunulan üçüncü örnek 2D arsa. Bu kez kesme ve damlacıkları coalescing kaynaklanır. Damlacıkları zarar eğilimli olduğunu dikkatli damlacık termal Bisiklete binme önce işleme, çok önemlidir. Biz otomatik damlacık üretimi, kullanımı tavsiye ne zaman elde edilebilir. El ile aktarma damlacıkları oluşturursa, önerilen wide-geçişli ipuçları seçin ve dikkatli pipetting tekniği kullanırım emin olun. Yavaş aspirasyon ve dağıtım, her yer alan ile 5-6 saniye içinde damlacık transferi gerektirir ve pipet ucu açılış damlacık kartuş dokunmatik değil veya iyi esastır. Dağıtımı, pipet ucu sıvı seviyede tutmak ve damlacıkları kullanılmış (görünümü için gösteri video) gibi yavaşça kaldırın. Son 2D çizim örnek pozitif ve negatif damlacık nüfus (şekil 4 d) arasında bir ayrım eksikliği gösterir. Bunun birkaç nedeni olabilir. Lizis arabellekleri ve son derece bozulmuş DNA, aşırı kullanılan deterjanlar gibi güçlü ÇSYİ inhibitörleri ayrılık kaybına neden olabilir. Bu durumda, bir temizlik adım cDNA sentezi ve dPCR (gibi bu protokol içinde adım 5 açıklanmıştır) arasında eklemeyi düşünün. Son olarak, ayrılık eksikliği da alt-optimal amplifikasyon koşulları nedeniyle olabilir ve PCR adım duruma getirilmesi de durulmalıdır. Şekil 5 temsil 984 gerçek dünya hasta içinde veri teslimi etrafında zaman örnek ve hızlı doğasını bu test iş akışı gösterilmektedir. Sonuçlar için tedavi eden hekim gibi erken 48 saat içinde (vakaların % 79) örnek alındığı ve vakaların % 95 72 saat içinde rapor edilmiştir. Sonuç olarak, kullanımı RNA kan toplama tüpler, kan ve RT-dPCR bir en iyi duruma getirilmiş iletişim kuralıyla uygun iç ve toplu denetimleri, göre en iyi duruma getirilmiş RNA ayıklama yordamlarından dolaşan stabilize hızlı test sistemi için sağlayabilir füzyon RNA çeşitleri NSCLC içinde ilgili doğru algılanması. Resim 1 : Kan örnek işleme adımları Fusion varyant NSCLC içinde deneyleri en yaygın RET ve özel ROS1 türevleri kullanarak algılama için bakış. (A)örnek test tam kan çizilir ve bir BCT numune toplama kiti klinik laboratuvar içinde sevk başlatılır. RNA dolaşan trombosit zenginleştirilmiş plazma içinde birden fazla kaynaktan ters ile belirli astar gen transkripsiyonu ve dPCR kullanmak için saf kurtarılır. Örnekleri damlacık nesil (emülsiyon), oluşan ticari olarak kullanılabilir bir sistem kullanarak işlenir amplifikasyon ve damlacık devam ediyor. Veri ticari olarak mevcut yazılımı kullanılarak analiz edilir. Test sonuçlarını sonra belgelenen ve geri testi isteyen hekim bildirdi. İşleminin sonucu serbest bırakmak için örnek alınmasından itibaren 72 saatlik bir zaman çerçevesi içinde çalışmak üzere tasarlanmıştır. (B) ROS1 ve (C) RET için sekiz türevleri içinde çoğaltılmış deneyleri kaplıdır. Biodesix Web sitesi izniyle uyarlanmıştır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Resim 2 : Analitik doğrulama. Hücre-hatları(a)ifade SDC4-ROS1 füzyon ve (B) CCDC6-RET füzyon toplam insan vahşi tipi RNA (WT RNA) bir arka planda seyreltilmiş. Her füzyon türevi, algılama sınırı % 0,2 değişik frekansta her varyant tahlil için ön tanımlı ölçütleri kullanarak kurulmuştur. Tüm örnekleri bu eşiğin en az 21 denetim gen kopyalarını da içeriyordu. % 5 EML4-ALK (ALK) standart bir arka planda vahşi tipi RNA’ın negatif bir sonuç tarafından doğrulandı tahlil özgüllük göstermek için test edildi. Analitik çoğaltılmış RNA standartları yüksek, orta ölçüldü ve (C) ROS1 ve (D) e. kesinlik düşük konsantrasyonlarda üç ishal aynı gün (iç-gün), üç ishal üç gün üst üste (arası gün) ve ile üzerinden değerlendirilir iki bağımsız işleç (arası işleç). Kopya sayısı ve standart sapmalar araçlarının gösterilir. Biodesix Web sitesi izniyle uyarlanmıştır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 3 : Toplu işlem denetim örnekleri ve sağlamlık veri. Multiplexed ROS1 tahlil dPCR 2D arsa(a)olumlu denetim için (B) Hayır ters transkriptaz kontrol ve (C) RNA şablon kontrol sonuçları. (D) denetimleri (hafta sonları ve tatil günleri hariç) 21 gün üst üste üzerinde işletilmiştir. ROS1 kontrol edildi 141 + / 439 olumlu için standart sapmalar +/-kopya numarası demek. Hiçbir ters transkriptaz ve hiçbir şablon kontrolleri de her gün çalıştırılan ve bunlar tüm negatif (veri gösterilmez). RET multiplexed tahlil dPCR 2D Arsa (E) olumlu denetim için (F) hiçbir ters transkriptaz denetim ve (G) RNA şablon kontrol sonuçları. (H) denetimleri (hafta sonları ve tatil günleri hariç) 21 gün üst üste üzerinde işletilmiştir. RET kontrol edildi 586 182 +/-olumlu için standart sapmalar +/-kopya demek. Değil hiçbir ters transkriptaz ve ayrıca her gün çalıştırılan ve Hepsi negatifti hiçbir şablon denetimler gösterilmiştir. Biodesix Web sitesi izniyle uyarlanmıştır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 4 : RT-dPCR sorun giderme. 2D kesme ve damlacıkları ve (D sergiler (A) hiçbir ters transkriptaz kontrolü (B) kirlilik yok RNA denetiminde (C) içinde kirlenme olduğunda temsil eden alt-optimal dPCR sonuç elde Arsalar ) kötü PCR koşul ve PCR inhibisyon optimize edilmiştir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 5 : Gerçekleştirme süresi (TAT). TAT (saat cinsinden) bir RNA değişken isteyen testler için derlenmiş (n = 984). Veri dışlar haftasonları, tatiller ve örnekleri için düzenlenen > Laboratuvar Test istek formları üzerinde eksik klinik bilgi nedeniyle 24 h. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Tablo 1: Ters transkripsiyon reaktifler için hazırlanması süreci denetimleri. Bileşen Birim 2 dPCR supermix sondalar için x(no 2′-deoxyuridine 5′-trifosfat) 10 ΜL 20 x varyant hedef astar/probları ayarla(450 nmol/L astar, 250 nmol/L FAM sonda) 1 ΜL Denetim hedef astar/sonda küme x 20(450 nmol/L astar, 250 nmol/L HEX sonda) 1 ΜL nükleaz ücretsiz su 1 ΜL cDNA 7 ΜL Tablo 2: Ana karışımı için hazırlanması dPCR. Adım Bisiklete binme Sıcaklık Zaman # Döngüleri Rampa oranı Enzim harekete geçirmek 95 ° C 10 dk 1 ~ 2 oC/s Denatürasyon 94 ° C 30 s 40 Tavlama/uzantısı 55 ° C 1 dk. Enzim devre dışı bırakma 98 ° C 10 dk 1 (İsteğe bağlı) tutun 4 ° C sonsuz 1 ~ 1 oC/s Tablo 3: Termal bisiklet koşullarını.

Discussion

RET ve ROS1 düzenlemeler ~ %3 NSCLC nüfus18içinde sürücü mutasyonların oluşturan. Nadir olmasına rağmen bu genetik değişiklikler tespiti hayati önem taşımaktadır. NSCLC hastalar bu değişiklikleri ile özellikle onko-protein13sonuçlar anormal kinaz aktivitesi inhibe hedefli tedavi yararlanabilirler. Diğer klinik çalışmalarda19‘ RET karşı etkili olmak göstermiştir iken bazı böyle terapiler zaten ROS1 olumlu NSCLC, olarak kullanılmak üzere FDA tarafından onaylanır.

Dijital PCR teknoloji sıvı biyopsisi uygulamalar20için idealdir hassasiyet sağlar. Bu teknolojiyi kullanmak için önemli kabulü olmuştur boş hücre DNA NSCLC4,6,21,22,23 olan hastalarda tümör mutasyonların ölçüm için dolaşan ile . CfDNA ek olarak, biz tümör RNA (şekil 1A)10dolaşan NSCLC olan hastalarda en yaygın füzyon versiyonlarının sağlam ölçüm için tasarlanmış bir iletişim kuralı geliştirilmiştir.

Bizim oluşturulmuş protokol algılama aşağı %0,2 (Şekil 2) analitik sınırları için izin verir. RT-dPCR son derece özel ve hassas olmakla birlikte, deneyleri panelindeki seçilen ve algılama PCR tahlil için multiplexed bilinen füzyon türevleri sınırlı olmalıdır. Böylece, çoğaltılmış deneyleri dahil edilecek füzyon NSCLC hastalar nüfusu içinde uygun kapsama sağlamak için dikkatle seçilmelidir. Başarıyla RET ve ROS1 için aynı anda sekiz füzyon türevleri sonuç RET veya ROS1 loci düzenlemeler dan algılayan ve sırasıyla % 99 ve RET ve ROS1 olumlu nüfusun % 88’i kapak deneyleri tasarladık (şekil 1B-C )17.

Bu çalışmada açıklandığı gibi son test iş akışı sonuçların tutarlılığı sağlamak için toplu denetimler de içerir. Bu denetimler hem olumlu bir analitik standart, hem de birlikte herhangi bir kirlenme veya toplu (şekil 3) içinde meydana gelen PCR inhibisyon sağlamak iki negatif denetimleri bulunur. Sağlamlık testin emin olmak için bir çalışma (şekil 3D, H) 21 günlük süre içinde toplu denetimlerini kullanarak gerçekleştirildi. Bu veriler bu protokolde belirlenen RNA işlem tutarlılık göstermektedir.

İyi laboratuvar uygulamaları ve uygun RNA işleme sağlam ve doğru sonuçlar sağlamak önemli bileşenleridir. Laboratuvar alanı ve donanımları özel ekipman her kullanımdan sonra temizlik, sarf malzemeleri ve RNase free reaktifler kullanarak ve bir RNase inactivation sprey tüm bulaşıcı RNases azaltmaya yardımcı çalışma alanı uygulayarak RNA ile kullanmak için. Vicdani RNA örnekleri teknisyenleri, özel laboratuvar önlüğü, dahil olmak üzere tarafından işlenmesi sık eldiven değişiklikleri hızlı bir şekilde RNA çıkarma yordamı ile çalışma, ve buz üzerinde koruma örnekleri örnek bütünlüğünü korumak için son derece önemlidir vardır. RNA transkripsiyonu cDNA için ters edildikten sonra yıkımı için daha az eğilimli daha istikrarlı bir form örneğidir. RNA bütünlüğü destekleyen uygulamalar ek olarak, yanlış pozitif sonuçlara neden olabilir çapraz kontaminasyonu önlemek için ayrılmış alanlarda PCR bileşenleri ve örnekleri sağlanmalıdır. PCR ana karışımları hazırlanması ve hisse senedi PCR reaktifler PCR şablonlardan ayrı tutulmalıdır ve büyük güçlendirilmiş şablonu (post-PCR) ayırmak için reaktifler, RNA ve cDNA örnekleri de dahil olmak üzere tüm önceden güçlendirilmiş malzemelerden özen gösterilmelidir. Son olarak, uygun üretimi ve işleme emülsifiye PCR karışımları amplifikasyon önce damlacık bütünlüğü ve en iyi dPCR koşulları korumak açısından Merkezi. Bu gibi önlemler tutarlı ve doğru sonuçlar elde etmek için bu iletişim kurallarını yürütülmesi sırasında kritik öneme sahiptir. Tüm veri sonuçları sürümünden önce eğitimli personel tarafından emin olmak için tüm QC ölçümleri karşılandığından emin incelenmesi gerekir. Suboptimal sonuçlar (şekil 4), söz konusu olduğunda toplu iş teknik personel ve laboratuvar müdürü tarafından gözden geçirilmesi ve yeniden işleme gerektirebilir.

RT-dPCR sonuçları erken örnek alındı ve örnek sonuçlarını bu çalışmada kullanılan ayarla test içinde % 95’i 24 saat olarak üretilen (n = 984) sipariş hekim 72 saatten az zaman giriş (şekil 5) rapor edilmiştir. Bu teslimi etrafında zaman Doktorlar çok sağlar bir süre içinde başlatılması uygun terapi sağlayan moleküler bilgi gerekli. Bu sonuçları daha önce bu geleneksel doku biyopsisi kullanılarak elde daha genellikle mevcuttur. NSCLC ve diğer kanserler için ek biyolojik benzer dolaşımdaki RNA tabanlı yaklaşımlar kullanarak geliştirilebilir ve aynı hızlı zaman-için-sonuçlarından yararlanacak. Örneğin, RT-dPCR kullanarak programlanmış ölüm Ligand 1 (PD-L1) mRNA transkript ölçümü hekimler immünoterapi seçenekleri hakkında bilgi. Ayrıca sıvı biyopsi yardımcı programı büyüyen bir ilgi ve dPCR için tedavi edici etkinliği izleme bulunmaktadır. Önceki dirilişi için belirli türevlerini test genomik kullanarak tümörü belirtileri doktorlar önce standart24görüntüleme gibi bakım önlemleri semptomatik hastalar tedavi rejimlerinin ayarlamak izin verebilir. Bu çalışmada bildirilen bir gibi protokoller onların invasiveness sigara, hassasiyet, hızlı teslimi etrafında zaman ve maliyet etkinliği nedeniyle izlemek için idealdir. Burada açıklanan tahlil sonuçları hızlı tedavi kararları kolaylaştırır ve doku tabanlı test4ile deneyimli bazı sınırlamalar kaçınmanızı sağlar örnek alınmasından itibaren en az yanlış algılama oranları, 72 saat içinde sağlar.

Bizim iletişim kuralı ve veri düşük bereket RNA çeşitleri yanı sıra klinik pratikte test kan tabanlı mutasyon olasılığını belirlemek için sağlam test sistemi göstermektedir. Bu para, ayrıca daha kapsamlı genom ve doku ve kan test Proteom bile daha geniş klinik bilgi sağlayabilir gibi hızlı hedeflenen sıvı biyopsi tarafından tanımlanan mutasyon işleme dönüştürülebilir bir sürücüsü var mı hastalar için yaklaşımlar tedavi planlama desteklemek için.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Biz bizim ortak teşekkür ederim, Stephen Jones, Nia Charrington, Dr. Dianna Maar ve Doktor Samantha Cooper onların tahlil tasarım dijital Biyoloji Merkezi’nden (Bio-Rad Inc CA) desteği; Nezar Rghei ve Dr. Moemen Abdalla (Norgen Biotek, Kanada) RNA ayıklama protokolü en iyileştirirken kritik tavsiye için; ve test gereksinimleri ve ticari izleme Shannon Campbell, Scott Thurston, Jeff Fensterer, Shannon Martello ve Joellyn Enos konusunda yardım almak için.

Materials

Ultrapure Distilled Water (DNAse, RNAse Free) (500 mL) Life Technologies 10977-015 1604071
Ultrapure Distilled Water (DNAse, RNAse Free) (500 mL) Life Technologies 10977-015 1809353
Nuclease-free water (molecular grade) Ambion AM9938 1604071
Nuclease-free water (molecular grade) Ambion AM9938 1606077
Phosphate Buffered Saline 1X, Sterile Amresco K812-500mL 1446C189
Phosphate Buffered Saline 1X, Sterile – 500 mL Invitrogen 10010023 1916C092
RNase Zap (Life Tech) (250 mL) Ambion AM9780 353952
Beta-Mercaptoethanol (BME)  (250 mL) CalbioChem 6050 W105B
OmniPur Ethyl Alcohol CalbioChem 4455-4L 56054611
OmniPur Ethyl Alcohol CalbioChem 4455-4L 56238638
Isopropyl Alcohol VWR 0918-4L 2116C416
TranscriptAid T7 High Yield Transcription Kit Thermo Scientific K0441 403648
TranscriptAid T7 High Yield Transcription Kit Thermo Scientific K0441 288461
DNase I Thermo K0441 371299
QIAzol Lysis Reagent Qiagen 79306 54809699
20x TE buffer pH 8.0 Alfa Aesar J62388 R13C548
UltraPure Agarose Invitrogen 16500-100 552730
10x TBE buffer Invitrogen AM9863 353065
Cell-Free RNA BCT Streck 218976 60110327
Cell-Free RNA BCT Streck 218976 61900327
Cell-Free RNA BCT Streck 218976 61480327
Cell-Free RNA BCT Streck 218976 62320327
Plasma/Serum Circulating and Exosomal RNA Purification Kit (Slurry Format) 50 preps Norgen 42800 585849
Plasma/Serum Circulating and Exosomal RNA Purification Kit (Slurry Format) 50 preps Norgen 42800 588308
Lysis Buffer Norgen 21205 A5F61E
RNA Cleanup and Concentration Micro-Elute Kit (Norgen) 50 preps Norgen 61000 585848
RNA Cleanup and Concentration Micro-Elute Kit (Norgen) 50 preps Norgen 61000 588309
DNA Clean and ConcentratorTM- 5  200 preps (samples) Zymo D4014 ZRC186976
DNA Clean and ConcentratorTM- 5  200 preps (samples) Zymo D4014 ZRC188077
DNA Clean and ConcentratorTM- 5  200 preps (samples) Zymo D4014 ZRC188413
Collection Tubes 500 pack Zymo C1001-500 N/A
SuperScript IV First Strand Synthesis System 200 rxn (samples) Life Technologies 18091200 391657
SuperScript IV First Strand Synthesis System 200 rxn (samples) Life Technologies 18091200 392504
SuperScript IV First Strand Synthesis System 200 rxn (samples) Life Technologies 18091200 448001
SuperScript IV Reverse Transcriptase Life Technologies 18090200 451702
Qubit HS RNA Assay Kit (500) Life Technologies Q32854 1745264
Qubit assay tubes (500) Life Technologies Q32856 13416Q311
ddPCR Supermix for Probes (no dUTP) Bio-Rad 1863023 64031651
ddPCR Supermix for Probes (no dUTP) Bio-Rad 1863023 64063941
ddPCR Supermix for Probes (no dUTP) Bio-Rad 1863023 64065740
ddPCR Supermix for Probes (no dUTP) Bio-Rad 1863023 64065741
ddPCR Supermix for Probes (no dUTP) Bio-Rad 1863023 64079083
ddPCR Buffer Control for Probes Bio-Rad 1863052 64025320
ddPCR Buffer Control for Probes Bio-Rad 1863052 64052358
gBlock KIF5B-RET K15:R12 IDT 151004172 4-Oct-16
gBlock KIF5B-RET K16:R12 IDT 151004173 4-Oct-16
gBlock KIF5B-RET K22:R12 IDT 151004174 4-Oct-16
gBlock KIF5B-RET K23:R12 IDT 151004175 4-Oct-16
gBlock KIF5B-RET K24:R11 IDT 151004176 4-Oct-16
gBlock KIF5B-RET K24:R8 IDT 151004177 4-Oct-16
gBlock CCDC6-RET C1:R12 IDT 151004178 4-Oct-16
gBlock TRIM33-RET T14:R12 IDT 151004179 4-Oct-16
RET exon 8 RT Gene Specific Primer IDT 150554385 28-Sep-16
5’-CTCCACTCACACCTG-3’ IDT 150554385 28-Sep-16
RET exon 11 RT Gene Specific Primer IDT 150554384 28-Sep-16
5’-GCAAACTTGTGGTAGCAG-3’ IDT 150554384 28-Sep-16
RET exon 12 RT Gene Specific Primer IDT 150554383 28-Sep-16
5’-CTGCCTTTCAGATGGAAG-3’ IDT 150554383 28-Sep-16
gBlock CD74-ROS1 C6:R34 IDT 152324366 15-Nov-16
gBlock CD74-ROS1 C6:R32 IDT 152324367 15-Nov-16
gBlock SDC4-ROS1 S2:R32 IDT 152324368 15-Nov-16
gBlock SDC4-ROS1 S2:R34 IDT 152324369 15-Nov-16
gBlock S13del2046-ROS1 S13del2046:R32 IDT 152324370 15-Nov-16
gBlock S13del2046-ROS1 S13del2046:R34 IDT 152324371 15-Nov-16
gBlock EZR-ROS1 E10:R34 IDT 152324372 15-Nov-16
gBlock TPM3-ROS1 T8:R35 IDT 152324373 15-Nov-16
ROS1 exon 34 RT Gene Specific Primer IDT 152704983 21-Nov-16
5’-CCTTCCTTGGCACTTT-3’ IDT 152704983 21-Nov-16
ROS1 exon 35 RT Gene Specific Primer IDT 152704985 21-Nov-16
5’-CTCTTGGGTTGGAAGAGTATG-3’ IDT 152704985 21-Nov-16
ALK Gene Specific Primer  IDT 140035422 26-Aug-16
5’-CAGTAGTTGGGGTTGTAGTCG-3’ IDT 140035422 26-Aug-16
EML4-ALK Cell line pellet Horizon Discovery N/A 11-Jun-15
SLC34A2-ROS1 Cell line pellet Horizon Discovery N/A 11-Jun-15
CCDC6-RET Cell line pellet Horizon Discovery N/A 11-Jun-15
Human Brain Total RNA Ambion AM7962 1703548
PrimePCR ddPCR Expert Design Assay: K15:R12  Bio-Rad N/A 17-Aug-16
PrimePCR ddPCR Expert Design Assay: K16:R12 Bio-Rad N/A 17-Aug-16
PrimePCR ddPCR Expert Design Assay: K22:R12 Bio-Rad N/A 17-Aug-16
PrimePCR ddPCR Expert Design Assay: K23:R12 Bio-Rad N/A 17-Aug-16
PrimePCR ddPCR Expert Design Assay: K24:R11 Bio-Rad N/A 17-Aug-16
PrimePCR ddPCR Expert Design Assay: K24:R8 Bio-Rad N/A 17-Aug-16
PrimePCR ddPCR Expert Design Assay: C1:R12 Bio-Rad N/A 17-Aug-16
PrimePCR ddPCR Expert Design Assay: T14:R12 Bio-Rad N/A 17-Aug-16
PrimePCR ddPCR Expert Design Assay: C6:R34 Bio-Rad /Biodesix N/A 6-Dec-16
PrimePCR ddPCR Expert Design Assay: C6:R32 Bio-Rad /Biodesix N/A 6-Dec-16
PrimePCR ddPCR Expert Design Assay: S2:R32 Bio-Rad /Biodesix N/A 6-Dec-16
PrimePCR ddPCR Expert Design Assay: S2:R34 Bio-Rad /Biodesix N/A 6-Dec-16
PrimePCR ddPCR Expert Design Assay: S13del2046:R32 Bio-Rad /Biodesix N/A 6-Dec-16
PrimePCR ddPCR Expert Design Assay: S13del2046:R34 Bio-Rad /Biodesix N/A 6-Dec-16
PrimePCR ddPCR Expert Design Assay: E10:R34 Bio-Rad /Biodesix N/A 6-Dec-16
PrimePCR ddPCR Expert Design Assay: T8:R35 Bio-Rad /Biodesix N/A 6-Dec-16
(version 2) Bio-Rad 12003909 213939881
PrimePCR ddPCR Expert Design Assay: ROS1 Multiplex (version 3.2) Bio-Rad N/A 13-Dec-16
PrimePCR ddPCR Expert Design Assay: ROS1 Multiplex (version 3.2) Bio-Rad N/A 20170112v3.2
PrimePCR ddPCR Gene Expression Probe Assay: GUSB, Human   Bio-Rad 10031257 212851151
PrimePCR ddPCR Gene Expression Probe Assay: GUSB, Human   Bio-Rad 10031257 207383915
PrimePCR ddPCR Gene Expression Probe Assay: GUSB, Human   Bio-Rad 10031257 195995635
PrimePCR ddPCR Gene Expression Probe Assay: GUSB, Human   Bio-Rad 10031257 212851152
PrimePCR ddPCR Gene Expression Probe Assay: GUSB, Human   Bio-Rad 10031257 213949301
PrimePCR ddPCR Expert Design Assay: EML4-ALK Bio-Rad 12003909 20160914
PrimePCR ddPCR Expert Design Assay: EML4-ALK Bio-Rad 12003909 211383227
Droplet Generation Oil for Probes Bio-Rad 186-3005 1065C220
Droplet Generation Oil for Probes Bio-Rad 186-3005 64052953
Droplet Generation Oil for Probes Bio-Rad 186-3005 64052358
Automated Droplet Generation Oil for Probes (20×96) Bio-Rad 186-4110 1065C320
Automated Droplet Generation Oil for Probes (20×96) Bio-Rad 186-4110 64052952
Automated Droplet Generation Oil for Probes (20×96) Bio-Rad 186-4110 64064127
DG8 Cartridges for QX100/QX200 Droplet Generator  Bio-Rad 186-4008 C000065883
DG8 Cartridges for QX100/QX200 Droplet Generator  Bio-Rad 186-4008 C000084276
DG8 Cartridges for QX100/QX200 Droplet Generator  Bio-Rad 186-4008 C000079928
DG8 Cartridges for QX100/QX200 Droplet Generator  Bio-Rad 186-4008 C000084395
DG8 Cartridges for QX100/QX200 Droplet Generator  Bio-Rad 186-4008 C000084634
Droplet Generator DG8 Gasket  Bio-Rad 186-3009 20160627
Droplet Generator DG8 Gasket  Bio-Rad 186-3009 20161107
Droplet Generator DG8 Gasket  Bio-Rad 186-3009 20161206
Droplet Generator DG8 Gasket  Bio-Rad 186-3009 20161216
Droplet Generator DG8 Gasket  Bio-Rad 186-3009 20170125
Pipet Tips for Automated Droplet Generator Bio-Rad 1864120 PR125340
DG32 Cartridge for Automated Droplet Generator (10-96 well plates)  Bio-Rad 186-4108 206894
DG32 Cartridge for Automated Droplet Generator (10-96 well plates)  Bio-Rad 186-4108 206893
Pierceable Foil Heat Seal  Bio-Rad 1814040 1409850
Pierceable Foil Heat Seal  Bio-Rad 1814040 100402
Pierceable Foil Heat Seal  Bio-Rad 1814040 145851
Microseal 'B' seals  Bio-Rad MSB1001 BR00428490
ddPCR Droplet Reader Oil Bio-Rad 186-3004 64039089
ddPCR Droplet Reader Oil Bio-Rad 186-3004 64049253
ddPCR Droplet Reader Oil Bio-Rad 186-3004 64049255
ddPCR Droplet Reader Oil Bio-Rad 186-3004 64081870
DNA Lo Bind Tube 0.5 mL Eppendorf 22431005 E1629620
DNA Lo Bind Tube 1.5 mL Eppendorf 22431021 F16698K
DNA Lo Bind Tube 2 mL Eppendorf 22431048 E160610I
50 mL Conicals, Polypropylene (25) Thermo 339652 G5ZF5W8118
TempAssure PCR 8-Strips, Optical Caps, Natural, polypropylene (120) USA Scientific 1402-4700 16202
For Rainin LTS Pipettors 0.5-20 µL tips Pipette.com LF-20 40155-642C4-642C
For Rainin LTS Pipettors 5-200 µL tips Pipette.com LF-250 40154-642C4-642B
Tips LTS 200 ul Filter 960/10 RT-L200F (10 boxes) Rainin 17002927 1635
Pipet Tips, 10 ul TipOne RPT ultra low retention filter tip refill cassette, sterile  USA Scientific 1181-3710 F1175551-1108
Pipet Tips, 10 ul TipOne RPT ultra low retention filter tip refill cassette, sterile  USA Scientific 1181-3710 F118054L-1720
Pipet Tips, 100 ul TipOne RPT ultra low retention filter tip refill cassette, sterile (10×96) USA Scientific 1180-1740 0014961Q-2501
Pipet Tips, 200 ul TipOne RPT ultra low retention filter tip refill cassette, sterile  USA Scientific 1180-8710 E116684P-1540
Pipet Tips, 1000 ul XL TipOne RPT ultra low retention filter tip refill cassette, sterile (10×96) USA Scientific 1182-1730 F118815P
5 mL Standard Racked Gilson-fit Reference Tips Scientific Specialties 4411-00 14312
Combitips advanced, 0.1 mL Biopur Eppendorf 003 008 9618 F165414H
Combitips advanced, 0.2 mL Biopur Eppendorf 0030 089.626 F166689J
Combitips advanced, 5 mL Biopur Eppendorf 0030.089 669 F166054J
Combitips advanced, 50 mL Biopur Eppendorf 003.008.9693 F166055I
Reagent Reservoir VWR 89094-680 141500
Twin tec PCR Plate 96, semi-skirted, Clear Eppendorf 951020303 E163697P
Twin tec PCR Plate 96, semi-skirted, Clear Eppendorf 951020303 F165029I
Twin tec PCR Plate 96, semi-skirted, Clear Eppendorf 951020303 F165028G
Twin tec PCR Plate 96, semi-skirted, Clear Eppendorf 951020303 E163697P
Twin tec PCR Plate 96, semi-skirted, Green Eppendorf 951020346 F166183K
Equipment Type Equipment ID
Analytical Balance EQP0125
Cryogenic Freezer 1, -80oC EQP0095
Refrigerator 6.1 cu ft GP06W1AREF EQP0139
-20oC Freezer EQP0140
Beckman Coulter Microfuge 22R EQP0025
Beckman Coulter Microfuge 22R EQP0124
Thermo Scientific Hereaus Megafuge 8 EQP0104
Mini Centrifuge EQP0131
Mini Centrifuge EQP0136
Mini Centrifuge EQP0134
Mini Centrifuge EQP0235
Mini Centrifuge EQP0216
Thermo Scientific HeraTherm Incubator EQP0105
Pipette 0.1 – 2.5 μL EQP0182
Pipette 0.1 – 2.5 μL EQP0072
Pipette 0.1 – 2.5 μL EQP0070
Pipette 0.5-10 μL EQP0218
Pipette 0.5-10 μL EQP0075
Pipette 0.5-10 μL EQP0169
Pipette 0.5-10 μL EQP0074
Pipette 0.5-10 μL EQP0147
Pipette 2 – 20 μL EQP0128
Pipette 2 – 20 μL EQP0160
Pipette 2 – 20 μL EQP0018
Pipette 2 – 20 μL EQP0146
Pipette 10 – 100 μL EQP0079
Pipette 10 – 100 μL EQP0181
Pipette 10 – 100 μL EQP0085
Pipette 10 – 100 μL EQP0077
Pipette 20 – 200 μL EQP0088
Pipette 20 – 200 μL EQP0087
Pipette 20 – 200 μL EQP0231
Pipette 100 – 1000 μL EQP0050
Pipette 100 – 1000 μL EQP0158
Pipette 100 – 1000 μL EQP0217
Pipette 100 – 1000 μL EQP0082
Pipette 100 – 1000 μL EQP0183
Pipette 100 – 1000 μL EQP0083
Pipette 5 mL EQP0153
Timer S/N 140623950
Hamilton SafeAire VAV Fume Hood EQP0206
Biosafety Cabinet EQP0205
Biosafety Cabinet EQP0204
Qubit 3.0 EQP0102
Benchmark Digital Heat Block EQP0108
Benchmark Digital Heat Block EQP0231
Polaroid Z2300 Instant Print Digital Gel Camera with WiFi and 16GB SDHC memory card EQP0111
Electrophoresis Power Unit EQP0113
Electrophoresis Small Gel Box EQP0116
Maestro Transilluminator EQP0118
Microwave EQP0215
Multichannel 8-well Pipette 2 -  20 μL EQP0207
Multichannel 8-well Pipette 10 – 100 μL EQP0090
Rainin Multichannel 8-well Pipette 50 μL EQP0094
Rainin Multichannel 8-well Pipette 50 μL EQP0161
Rainin Multichannel 8-well Pipette 50 μL EQP0162
Rainin Multichannel 8-well Pipette 50 μL EQP0163
Vortex Genie 2 EQP0052
Vortex Genie 2 EQP0007
Vortex Genie 2 EQP0132
Vortex Genie 2 EQP0137
Vortex Genie 2 EQP0135
Air Clean PCR Workstation EQP0203
Air Clean PCR Workstation EQP0096
Air Clean PCR Workstation EQP0148
Air Clean PCR Workstation EQP0097
QX200 Droplet Generator  EQP0202
QX200 Droplet Generator EQP0121
Automated Droplet Generator EQP0179
PX1 PCR Plate Sealer EQP0123
PX1 PCR Plate Sealer EQP0186
C1000 Touch Cycler w/96W FS RM EQP0120
S1000 Cycler w/96W FS RM EQP0174
S1000 Cycler w/96W FS RM EQP0173
T100 Thermal Cycler EQP0180
T100 Thermal Cycler EQP0175
QX200 Droplet Reader EQP0194
QX200 Droplet Reader EQP0122
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ignatiadis, M., Lee, M., Jeffrey, S. S. Circulating Tumor Cells and Circulating Tumor DNA: Challenges and Opportunities on the Path to Clinical Utility. Clin Cancer Res. 21 (21), 4786-4800 (2015).
  2. Alix-Panabieres, C., Pantel, K. Clinical Applications of Circulating Tumor Cells and Circulating Tumor DNA as Liquid Biopsy. Cancer Discov. , (2016).
  3. Paxton, A. Is Molecular AP testing in sync with guidelines. CAP Today. , (2014).
  4. Sacher, A. G., et al. Prospective Validation of Rapid Plasma Genotyping for the Detection of EGFR and KRAS Mutations in Advanced Lung Cancer. JAMA Oncol. , (2016).
  5. Sozzi, G., et al. Quantification of free circulating DNA as a diagnostic marker in lung cancer. J Clin Oncol. 21 (21), 3902-3908 (2003).
  6. Oxnard, G. R., et al. Noninvasive detection of response and resistance in EGFR-mutant lung cancer using quantitative next-generation genotyping of cell-free plasma DNA. Clin Cancer Res. 20 (6), 1698-1705 (2014).
  7. Best, M. G., et al. RNA-Seq of Tumor-Educated Platelets Enables Blood-Based Pan-Cancer, Multiclass, and Molecular Pathway Cancer Diagnostics. Cancer Cell. 28 (5), 666-676 (2015).
  8. Rodriguez, M., et al. Different exosome cargo from plasma/bronchoalveolar lavage in non-small-cell lung cancer. Genes Chromosomes Cancer. 53 (9), 713-724 (2014).
  9. Kalluri, R. The biology and function of exosomes in cancer. J Clin Invest. 126 (4), 1208-1215 (2016).
  10. Mellert, H., et al. Development and Clinical Utility of a Blood-Based Test Service for the Rapid Identification of Actionable Mutations in Non-Small Cell Lung Carcinoma. J Mol Diagn. 19 (3), 404-416 (2017).
  11. Qin, J., Williams, T. L., Fernando, M. R. A novel blood collection device stabilizes cell-free RNA in blood during sample shipping and storage. BMC Res Notes. 6, 380 (2013).
  12. Chomczynski, P. A reagent for the single-step simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from cell and tissue samples. Biotechniques. 15 (3), 532-537 (1993).
  13. Kohno, T., et al. Beyond ALK-RET, ROS1 and other oncogene fusions in lung cancer. Transl Lung Cancer Res. 4 (2), 156-164 (2015).
  14. Takeuchi, K., et al. ROS1 and ALK fusions in lung cancer. Nat Med. 18 (3), 378-381 (2012).
  15. Rimkunas, V. M., et al. Analysis of receptor tyrosine kinase ROS1-positive tumors in non-small cell lung cancer: identification of a FIG-ROS1 fusion. Clin Cancer Res. 18 (16), 4449-4457 (2012).
  16. Tsuta, K., et al. RET-rearranged non-small-cell lung carcinoma: a clinicopathological and molecular analysis. Br J Cancer. 110 (6), 1571-1578 (2014).
  17. Forbes, S. A., et al. COSMIC: somatic cancer genetics at high-resolution. Nucleic Acids Res. 45 (1), 777-783 (2017).
  18. Salgia, R. Diagnostic challenges in non-small-cell lung cancer: an integrated medicine approach. Future Oncol. 11 (3), 489-500 (2015).
  19. Cagle, P. T., Raparia, K., Portier, B. P. Emerging Biomarkers in Personalized Therapy of Lung Cancer. Adv Exp Med Biol. 890, 25-36 (2016).
  20. Vogelstein, B., Kinzler, K. W. Digital PCR. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (16), 9236-9241 (1999).
  21. Oxnard, G. R., et al. Association Between Plasma Genotyping and Outcomes of Treatment With Osimertinib (AZD9291) in Advanced Non-Small-Cell Lung Cancer. J Clin Oncol. 34 (28), 3375-3382 (2016).
  22. Reckamp, K. L., et al. A Highly Sensitive and Quantitative Test Platform for Detection of NSCLC EGFR Mutations in Urine and Plasma. J Thorac Oncol. 11 (10), 1690-1700 (2016).
  23. Yanagita, M., et al. A prospective evaluation of circulating tumor cells and cell-free DNA in EGFR mutant non-small cell lung cancer patients treated with erlotinib on a phase II trial. Clin Cancer Res. , (2016).
  24. Abbosh, C., et al. Phylogenetic ctDNA analysis depicts early-stage lung cancer evolution. Nature. 545 (7655), 446-451 (2017).
  25. Chomczynski, P. A reagent for the single-step simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from cell and tissue samples. BioTechniques. 15 (3), 532-534 (1993).

Tags

Blood-based TestROS1RETFusion TranscriptsCirculating Ribonucleic AcidDigital Polymerase Chain ReactionTumor-derived RNAOncology DiagnosticsMinimally InvasiveNSCLCReverse TranscriptionCDNAPCRFluorescent Probes

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Mellert, H. S., Alexander, K. E., Jackson, L. P., Pestano, G. A. A Blood-based Test for the Detection of ROS1 and RET Fusion Transcripts from Circulating Ribonucleic Acid Using Digital Polymerase Chain Reaction. J. Vis. Exp. (134), e57079, doi:10.3791/57079 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image