Um sangue com base em teste para a detecção de ROS1 e RET transcrições de fusão do ácido ribonucleico, usando a reação em cadeia da polimerase Digital de circulação

Este protocolo descreve um sistema de teste desenvolvido para a detecção de variantes de fusão de RNA para uso na medição de mutações de motorista dentro do plasma de pacientes NSCLC (Figura 1A). Fusão mRNA produtos da expressão das rearranjos RET e ROS1 mais comuns na população de NSCLC foram identificados13,14,15,16,17. Ensaios PCR multiplexados então foram projetados para detectar as oito variantes mais comuns de transcrição para cada destino em NSCLC dentro de uma única reação. As translocações mais comuns para o locus ROS1 geram associações com as porções 5′ do CD74, SDC4, SLC34A2, EZR ou genes TPM3 (Figura 1B). As translocações mais comuns para o locus RET levam a justaposição com KIF5B, para os quais o ensaio abrange seis junções exon. Parceiros RET adicionais que são cobertos incluem aqueles com CCDC6 e TRIM33 (Figura 1C). No total, os ensaios cobrem cerca de 88% da ROS1 e 99% das alterações de RET conhecidas para ocorrer na população de pacientes de NSCLC17. A especificidade dos componentes do ensaio primeiro foi avaliada usando oito individuais em vitro RNAs que contêm a sequência do mRNA para as transcrições de fusão abrangidas pelo ROS1 ou RET multiplexagem ensaios. Cada espécie de RNA foi testado contra cada variante do ensaio individual que compreende a versão multiplexada. Não havia nenhuma reatividade cruzada destes ensaios, demonstrando assim 100% especificidade analítica dentro do projetado multiplexado ensaios (dados não mostrados). Para determinar o limite inferior de detecção do protocolo teste, RNA total derivado de linhagens celulares expressando uma variante de fusão incluída no ensaio foram misturadas em um fundo de RNA normal em concentrações de 5%, 1%, 0,2% e 0,04%. Os multiplexado RET ROS1 variante PCR ensaios e detectados tão pouco como variante de fusão de 0,2% (Figura 2A-B). Além disso, uma preparação de 5% fora do alvo linhagem celular derivada RNA (expressando uma transcrição de fusão EML4-ALK) não foi detectado com os ensaios ROS1 e RET multiplexados, demonstrando ainda mais a especificidade (Figura 2A-B). Foram realizados testes de precisão do processo RT-dPCR para ambos ROS1 e RET Analytic controle material composto equimolar em vitro RNAs foi processado em três concentrações (baixa, média e alta) através da transcrição reversa e dPCR em três ocasiões diferentes dentro do mesmo dia (intradia), em três dias consecutivos (inter dia) e com dois operadores (inter operador). Resultados dos testes de precisão demonstraram a detecção precisa da transcrição de fusão de interesse, bem como um gene de controle, GUSB, que é incluído como uma métrica QC interna (Figura 2-D). Além do controle interno GUSB, cada lote de amostras clínicas foi executado com um conjunto de controles de lote. Um controle positivo foi desenvolvido de uma mistura de analítica em vitro RNA que cada uma das variantes fusão testados em RT-dPCR representado, bem como analítica em vitro RNA para GUSB. Este RNA foi cravado em plasma humano normal lisado durante a extração do RNA e foi processada juntamente com as amostras clínicas em todo o protocolo. O não controle da transcriptase reversa (RT n) era um controlo negativo para confirmar a ausência de material contaminante no fluxo de trabalho de extração do RNA e demonstrar a especificidade dos primers de RNA. O controle de RT não foi gerado usando o mesmo material como o controle positivo, mas não inclui enzima dentro da reação de síntese do cDNA. A sem controle de RNA (NRC) é um controle negativo para confirmar a ausência de contaminantes transcrições nos componentes de reação de transcrição reversa. Esse controle foi introduzido o fluxo de trabalho na etapa de síntese do cDNA, e água foi adicionada na reação ao invés de um modelo de RNA. Os controles não RT e NRC devem ser negativos em ambos os canais, se resultados precisos devem ser entregues. A tabela 1 lista os componentes de reação de transcrição reversa para cada controle. Exemplos de 2D parcelas para cada um desses controles são mostrados para o ROS1 (Figura 3 A-C) e ensaios de multiplex RET (Figura 3 E-G). Variantes de fusão foram detectadas usando uma sonda de amidite (FAM) de fluoresceína e são representadas ao longo do eixo y, enquanto o gene de controle, GUSB, foi detectado usando uma sonda de 5′-hexacloro-fluoresceína-CE phosphoramidite (HEX) e no eixo x. Esses controles de lotes foram avaliados ao longo de 21 dias para determinar a robustez do ensaio. Gotículas de fusão positivas e gotículas de gene GUSB controle foram observadas para ROS1 e RET em todas as execuções de 21, executadas ao longo do estudo (Figura 3D, H). Todos os controles negativos (n RT e NRC) produziram resultados negativos entre os dias 21 (dados não mostrados). A capacidade de solucionar problemas é um componente crítico de qualquer protocolo de teste a ser executado na configuração de laboratório clínico. Aqui, nós fornecemos exemplos do mundo real dos resultados abaixo do ideal, usando o protocolo de RT-dPCR. O primeiro é um plano 2D exemplo demonstra a importância de nenhum controle de transcriptase reversa(Figura 4). Neste exemplo, gotículas positivas mutantes estiveram presentes, mesmo que não havia nenhuma conversão de cDNA devido à falta da enzima. Este resultado foi provavelmente devido dPCR primers amplificar DNA genômico fora do alvo. Neste caso, projeto de um ensaio que mede intrão impedirá a amplificação do DNA genômico. Alternativamente, uma enzima DNase RNase-livre pode ser usada para eliminar o DNA contaminante, mas isso não é recomendado para a deteção de alvos raros, como alguma degradação do RNA pode ocorrer durante a incubação com a enzima. A próxima trama 2D exemplo era um NRC com gotículas positivas em ambos os canais (Figura 4B). Isto indica contaminação em algum momento da configuração do RT-dPCR. Neste caso, a recomendação é descartar qualquer potencialmente contaminados os reagentes utilizados nos testes, completamente descontaminar todo o equipamento e re-teste com componentes de reação de fresco. O terceiro lote 2D exemplo apresentado como um spray de gotas ao longo de uma linha de 45° (Figura 4C). Isto é frequentemente causado por cisalhamento e coalescência das gotículas. Gotícula cuidadosa manipulação antes da ciclagem térmica é essencial, como as gotas são propensas a danos. Recomendamos o uso da geração automatizada da gota, quando disponível. Se transferir manualmente gerado gotículas, é certo que escolher as dicas de largo diâmetro recomendadas e empregam a técnica de pipetagem cuidadosa. Transferência da gota requer lenta aspiração e dispensação, com cada ocorrendo em 5-6 segundos, e é essencial que a abertura de ponta de pipeta não toque o cartucho da gota ou bem. Quando dispensar, manter a ponta da pipeta no nível do líquido e levantá-lo lentamente, como as gotas são dispensada (exibição do vídeo de demonstração). O exemplo de plotagem 2D final demonstra uma falta de separação entre as populações de gotículas positivos e negativos (Figura 4). Isso pode ter várias causas. Inibidores da PCR fortes, como detergentes usados em buffers de Lise e excesso de DNA altamente degradada, podem causar a perda da separação. Neste caso, considere a adição de uma etapa de limpeza entre a síntese do cDNA e dPCR (como descrito no passo 5 deste protocolo). Finalmente, falta de separação também pode ser devido a condições de amplificação sub-ótimo e otimização da etapa PCR também deve ser considerada. Dados no paciente 984 do mundo real de Figura 5 representam vezes reviravolta da amostra e demonstra a natureza rápida do fluxo de trabalho teste. Os resultados foram relatados para o médico de tratamento tão cedo como dentro de 48 horas (79% dos casos) do recebimento da amostra e em 95% dos casos, no prazo de 72 horas. Em conclusão, a utilização de estabilizado circulando RNA tubos de colheita de sangue, procedimentos de extração de RNA otimizados de sangue e RT-dPCR executar de acordo com um protocolo otimizado com o apropriado interno e controles do lote, pode fornecer um sistema de teste rápido para a detecção precisa de variantes de RNA de fusão relevantes em NSCLC. Figura 1 : Visão geral das etapas processamento de amostra de sangue para detecção de variantes de fusão usando ensaios específicos para os mais prevalentes RET e ROS1 variantes em NSCLC. (A) amostra de teste é iniciado quando o sangue total é desenhado e uma BCT é enviado dentro do kit de coleção de amostra para o laboratório clínico. RNA de circulação é recuperado de múltiplas fontes dentro do plasma enriquecido em plaquetas, reverso transcrito com escorva específica do gene e purificada para uso em dPCR. As amostras são processadas usando um sistema comercialmente disponível que consiste de geração de gotas (emulsão), amplificação e contando com gota. Dados são analisados utilizando o software disponível comercialmente. Os resultados do teste são então documentados e reportados volta ao médico, solicitando-teste. O processo foi concebido para funcionar dentro de um prazo de 72 horas da data de recepção da amostra para liberação do resultado. Oito variantes para ROS1 (B) e (C) RET são abrangidas os ensaios multiplexados. Adaptado do site Biodesix com permissão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2 : Validação analítica. Linhagens celulares expressando (A) SDC4-ROS1 fusão e fusão (B) CCDC6-RET foram diluídas em um fundo do RNA do selvagem-tipo humano total (WT RNA). Com cada variante de fusão, o limite de detecção foi estabelecido em 0,2% frequência variante usando critérios pré-definidos para cada variante ensaio. Todas as amostras acima desse limite também continham pelo menos 21 cópias do gene de controle. Padrão de EML4-ALK (ALK) 5% em um fundo do selvagem-tipo RNA foi testado para demonstrar a especificidade do ensaio, que foi confirmada por um resultado negativo. Normas analíticas de RNA multiplexadas foram medidas em alta, média e baixas concentrações ROS1 (C) e (D) RET. precisão foi avaliada sobre três corridas no mesmo dia (Intradia), três corridas em três dias consecutivos (inter dia) e com dois operadores independentes (inter operador). Os meios de cópia número e desvios-padrão são mostrados. Adaptado do site Biodesix com permissão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3 : Lote processamento exemplos de controle e robustez dados. Terreno 2D do ROS1 multiplexado ensaio dPCR não resultados para controle positivo (A), (B) sem controle de transcriptase reversa e (C) nenhum controle do modelo de RNA. (D) controles foram executados em 21 dias consecutivos (excluindo sábados, domingos e feriados). Quer dizer cópia número + /-desvios-padrão para ROS1 positivo controle eram 439 + /-141. Não transcriptase reversa e sem controles de modelo também foram executados em cada dia, e estes eram todos negativos (dados não mostrados). Terreno 2D do RET multiplexado ensaio dPCR não resultados para controle positivo (E), (F) sem controle de transcriptase reversa e (G) nenhum controle do modelo de RNA. (H) controles foram executados em 21 dias consecutivos (excluindo sábados, domingos e feriados). Quer dizer cópias + /-desvios-padrão para RET positivo de controle foram 586 + /-182. Não mostrados são não transcriptase reversa e sem controles de modelo também foram executados em cada dia e todos negativos. Adaptado do site Biodesix com permissão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 4 : Solucionando problemas de RT-dPCR. 2D parcelas representando sub-ótimo dPCR os resultados obtidos quando há contaminação (por) dentro do controle não transcriptase reversa, contaminação (B) dentro do controle sem RNA, (C) cisalhamento e coalescência das gotículas e (D ) mal otimizado condições do PCR ou inibição de PCR. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 5 : Tempo de retorno (TAT). TAT (em horas) foi compilado para testes, solicitando uma variante de RNA (n = 984). Dados exclui fins de semana, feriados e amostras realizadas por > 24 h devido à incompleta informação clínica sobre o formulários de solicitação de teste de laboratório. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Tabela 1: Preparação de reagentes de transcrição reversa para controles de processo. Componente de Volume de 2 x dPCR supermix para sondas(nenhum desoxiuridina 2′-5′-trifosfato) 10 Μ l conjunto de 20 x variante alvo cartilhas/sondas(450 nmol/L primeiras demão, sonda de FAM 250 nmol/L) 1 Μ l 20 x controle conjunto de primers/sonda de destino(450 nmol/L primeiras demão, sonda HEX 250 nmol/L) 1 Μ l água livre de nuclease 1 Μ l cDNA 7 Μ l Tabela 2: Preparação da mistura mestre dPCR. Etapa de ciclismo Temperatura Tempo # Ciclos Taxa de rampa Ativação da enzima 95 ° C 10 min 1 ~ 2 oC/s Desnaturação 94 ° C 30 s 40 Recozimento/extensão 55 ° C 1 min Desativação da enzima 98 ° C 10 min 1 Segure (opcional) 4 ° C infinita 1 ~ 1 óC/s Tabela 3: Condições de ciclagem térmicas.