血液ベース ROS1 の検出のためのテストし、デジタル ポリメラーゼ連鎖反応を使用してリボ核酸を循環から融合の成績証明書を RET

このプロトコルでは、非小細胞肺癌患者 (図 1A)、プラズマ内でドライバー変異の測定で使用するための RNA 融合亜種の検出のために開発された試験システムについて説明します。融合 mRNA 非小細胞肺癌の人口における最も一般的な RET と ROS1 再編成の式からの製品には、13,14,15,16,17が識別されます。多重 PCR の試金は単一の反作用の内で非小細胞肺癌のターゲットごとに 8 つの最も一般的なトラン スクリプトのバリエーションを検出する、設計されていた。ROS1軌跡で最も一般的な転座CD74、 SDC4、 SLC34A2、 EZRやTPM3遺伝子 (図 1B) の 5′ 部分とのアソシエーションを生成します。RET遺伝子座で最も一般的な転座は、アッセイが六つのエキソン接合をカバー KIF5B並置に します。覆われている追加のRETパートナーには、これらのCCDC6とTRIM33 (図 1C) が含まれます。合計では、法は、約 88% をカバー ROS1 の非小細胞肺癌患者人口17で発生すること知られている RET の変異の 99%。 分析コンポーネントの特異性は最初 ROS1 または RET 融合成績多重アッセイの mRNA シーケンスを含む 8 つの個々の in vitro Rna を使用して評価されます。各 RNA 種は、各多重バージョンを構成する個々 のバリアント アッセイに対してテストされました。これらのアッセイの交差反応性はなく、デモは 100% 設計内解析的特異性多重アッセイ (データは示されていない)。テスト プロトコルの検出下限値を決定するには、アッセイに含まれる融合バリアントを表現する細胞株由来の総 RNA は 5%、1%、0.2%、0.04% の濃度で通常の RNA の背景に混合しました。多重 RET と ROS1 バリアント PCR の試金 0.2% 融合バリアント (図 2A B) 同様に少しを検出しました。さらに、5% の準備オフのターゲット細胞株 (EML4 ALK 融合転写産物発現) 派生 RNA 検出されなかった多重 ROS1 と RET の分析でさらに特異性 (図 2A B) を示します。 両方 ROS1 RT dPCR プロセスの精密な品質検査を行ったし、等モルの in vitro Rna から成る中国と分析制御材料 (高、中、低) の 3 つの濃度で逆のトランスクリプションおよび 3 dPCR 経由で処理されました。同じ日 (日中)、2 つの演算子 (間演算子) と連続 3 日間 (間日) 内で別の機会に。精度のテストからの結果は、関心の融合転写制御遺伝子、GUSB 内部の品質管理指標 (図 2-D) として含まれている両方の正確な検出を示した。 GUSB 内部統制に加えて臨床サンプルの各バッチはバッチ コントロールのセットが実行されました。肯定的な制御には、GUSB のため、各 RT-dPCR でテスト融合バリエーションを表す RNA として分析の in vitro RNA の解析体外の混合物から開発されました。この RNA は正常ひと血漿ライセート中に RNA の抽出にスパイクだったし、プロトコルを通して臨床サンプルと一緒に処理されました。制御なしの逆転写酵素 (RT なし) は、RNA 抽出ワークフローにおける汚染物質の有無を確認し、RNA のプライマーの特異性を示す陰性対照だった。いいえ RT 制御は、肯定的な制御と同じ素材を使用して生成されましたが、cDNA 合成反応内酵素は含まれません。ないの RNA 制御 (NRC) は、逆転写反応コンポーネントの転写物の汚染の有無を確認する否定的なコントロールです。このコントロールが導入された cDNA 合成段階でワークフローと RNA テンプレートではなく反応で水が追加されました。なし RT と NRC のコントロールは正確な結果が配信される場合、両方のチャネルに負である必要があります。表 1は、各コントロールの逆転写反応コンポーネントを示します。ROS1 のこれらのコントロールのそれぞれの 2 D プロットの例が表示されます (図 3 A ~ C) と RET (図 3 E G) マルチプレックスアッセイ。融合亜種フルオレセイン amidite (FAM) プローブを用いて検出された GUSB、制御遺伝子の 5′-hexachloro-フルオレセイン-CE ホスホロアミダイト (HEX) プローブを用いた検出された間、y 軸沿いに表され、x 軸上です。これらのバッチ コントロールは、アッセイの堅牢性を決定するため 21 日間にわたって評価されました。核融合肯定的な液滴と GUSB 制御遺伝子液滴 ROS1 と RET の認められた (図 3D, H) 研究のコース上で実行すべての 21 の実行.すべての否定的なコントロール (いいえ RT および NRC) は、全体の 21 日 (データは示されていない) の間で否定的な結果をもたらした。 トラブルシューティングを行う能力は、検査設定で実行する任意のテスト プロトコルの重要なコンポーネントです。ここでは、我々 は RT dPCR プロトコルを使用してサブ最適な結果の実世界の例を提供します。最初のない逆転写酵素コントロール (図 4A) の重要性を示す例 2 D プロットです。この例では、酵素の不足により cDNA 変換はありませんでしたにもかかわらず肯定的な突然変異体の液滴が存在しました。この結果はターゲットからゲノム DNA を増幅 dPCR プライマーによる可能性が高かった。この例では、イントロンにまたがるアッセイのデザインは、ゲノム DNA の増幅を防ぐが。また、RNase フリーの DNase 酵素は汚染の DNA を除去するために使用できますが、これは推奨されませんまれなターゲットの検出のため、いくつかの RNA 分解酵素と潜伏中に発生します。次の使用例 2 D プロットは両方のチャネル (図 4B) に肯定的な液滴と NRC だったこれには、RT dPCR セットアップでいくつかの時点で汚染が示されます。この場合は、テストで使用される可能性のある汚染された試薬を破棄、徹底的にすべての機器を消毒して新鮮な反応コンポーネントを再テストをお勧めします。3 番目の例 2 D プロット (図 4C) 45 ° 線に沿って液滴のスプレーとして提示します。これは多くの場合せん断と液滴の合体が原因です。液滴は損傷しやすく、慎重な液滴の熱サイクルにかける前の処理が不可欠です。自動化された液滴生成の使用をお勧めしますが利用可能。手動で転送すると水滴が生成された場合する推奨ワイドボア ヒントを選択し、慎重な分注技術を採用します。溶滴移行遅い吸引と各撮影場所 5-6 秒以上と調剤を必要と、それはピペット先端開口は液滴カートリッジを触れたり、よくない不可欠です。調剤、液体レベルでピペット チップを保つし、液滴ディスペンサー (ビューのデモのビデオ) は、それをゆっくりと上げます。最終的な 2 D プロット例を示します (図 4) の正と負の液滴集団間の分離の欠如。これは、いくつかの原因があります。換散バッファーの高い劣化 DNA の過剰使用される洗剤など強い PCR 阻害剤には、分離の損失が生じます。この場合、cDNA を合成して dPCR (ようこのプロトコルの手順 5 で記述されている) のクリーンアップ手順を追加することを検討してください。最後に、サブ最適な増幅条件のために分離の欠如することができ、PCR のステップの最適化も考慮する必要があります。 図 5を表す 984 現実世界患者内のデータは、ターンアラウンド時間のサンプルし、このテストのワークフローの迅速な性質を示します。結果は、48 時間以内 (79% 例) 領収書のサンプルと 95% の場合、72 時間以内として、早ければ治療医師に報告されました。結論としての使用の急速なテスト システムを提供できる RNA 採血管、血と RT dPCR 内部適切な最適化されたプロトコルおよびバッチ コントロールに従って実行から最適化された RNA 抽出手順を循環を安定化融合 RNA 亜種非小細胞肺癌に関連する高精度で検出。 図 1: 非小細胞肺癌で最も普及している RET と ROS1 亜種にアッセイ固有を使用して融合バリアント検出のための血液サンプル処理手順の概要です。(A) 全血が描画され、臨床検査室に標本コレクション キット内で、BCT を出荷時にサンプル テストを開始します。RNA の循環を回復濃縮した血小板血漿内の複数のソースから逆遺伝子特定プライミングと転写の dPCR で使用するため精製で。サンプルは、液滴生成 (乳剤) から成っている市販のシステムを使用して処理される増幅、および液滴を数えます。市販のソフトウェアを使用してデータを分析します。テストの結果は文書化し、テストを要求する医師に報告します。プロセスは、結果リリースに領収書のサンプルから 72 時間の期間内に動作するように設計されています。ROS1 (B) と (C) RET の 8 つのバリエーションは、多重アッセイ内で覆われています。許可を得て Biodesix ウェブサイトから適応。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 2: 分析検証します。表現する細胞 (A) (B) CCDC6 RET 融合と SDC4 ROS1 融合総人間野生型 RNA (WT RNA) のバック グラウンドで希釈されました。各融合バリアント検出限界は 0.2% 周波数各バリアントの試金のための定義済みの条件を使用してに設立されました。このしきい値を超えるすべてのサンプルには、制御遺伝子の少なくとも 21 のコピーも含まれています。野生型 RNA のバック グラウンドで 5% EML4 ALK (アルク) 標準は、否定的な結果によって確認されたアッセイの特異性を示すテストされました。分析の多重 RNA 基準高、中で測定し、ROS1 (C) と (D) 中国と精度の低濃度が同じ日 (日中) に 3 失点、3 日間連続 (1 日間) と 3 つの動作を評価し2 つの独立した演算子 (間演算子)。コピー数と標準偏差の意味が表示されます。許可を得て Biodesix ウェブサイトから適応。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 3: バッチ コントロールの例と堅牢性データを処理します。ROS1 多重アッセイ dPCR の 2次元プロットの結果 (A) 肯定的な制御、(B) なしの逆転写酵素の制御、および (C) ない RNA テンプレート コントロール。(D) コントロール (土日祝日を除く) 21 の連続した日に実行されました。陽性コントロール 141 ± 439 ROS1 のための標準偏差 ± コピー数を意味します。ない逆転写酵素とはテンプレート コントロールもそれぞれの日に実行された、これらがすべて負 (データは示されていない)。RET 多重アッセイ dPCR の 2次元プロットの結果 (E) 肯定的な制御、(F) (G) と逆転写酵素操縦不能ない RNA テンプレート コントロール。(H) コントロール (土日祝日を除く) 21 の連続した日に実行されました。RET 陽性コントロール 182 +/-586 の標準偏差 ± コピーを意味します。ない逆転写酵素とそれぞれの日に実行されたも、すべて陰性だったないのテンプレート コントロールは、表示されません。許可を得て Biodesix ウェブサイトから適応。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 4: RT dPCR をトラブルシューティングします。2D プロット表す最適 dPCR 得られた結果 (A) ないの逆写コントロールでは、ないの RNA コントロールでは、(C) (B) 汚染汚染がある場合せん断とし (D の結合) 不十分な PCR の状態または PCR 阻害を最適化します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 5: 所要時間 (TAT).TAT (単位は時間) でコンパイルされたテスト RNA バリアントを要求する (n = 984)。週末、祝日、およびサンプルの開催データを除外 > 実験室テスト依頼フォーム臨床情報が不完全なため 24 h。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 表 1: プロセス コントロールの逆のトランスクリプション試薬の準備。 コンポーネント ボリューム dPCR スーパーミックス プローブ x 2(ない-2′-デオキシウリジン 5′-三リン酸塩) 10 Μ L 20 x バリエーション ターゲットのプライマー ・ プローブ セットします。(250 nmol/L FAM 450 nmol/L プライマー プローブ) 1 Μ L 制御対象のプライマー ・ プローブ セット × 20(450 nmol/L プライマー、250 nmol/L ヘックス プローブ) 1 Μ L ヌクレアーゼ フリー水 1 Μ L cDNA 7 Μ L 表 2: dPCR マスター ミックスの準備。 ステップをサイクリング 温度 時間 # サイクル ランプに入る率 酵素活性化 95 ° C 10 分 1 〜 2 oC/s 変性 94 ° C 30 s 40 焼鈍/拡張機能 55 ° C 1 分 酵素を不活性 98 ° C 10 分 1 (省略可能) 保持します。 4 ° C 無限 1 〜 1 oC/s 表 3: 熱サイクリング条件。