Examinar las conexiones Monosynaptic en Drosophila utilizando canales de sodio Tetrodotoxin resistentes

Una meta importante de la neurociencia es mapear las conexiones entre las neuronas para entender cómo fluye la información a través de circuitos. Numerosos enfoques y recursos se han convertido en disponibles para probar la conectividad funcional entre las neuronas en una gama de modelo sistemas^1,2. Para generar los diagramas más precisos utilizando electrofisiología, es importante resolver si las conexiones observadas entre dos células son directos y monosynaptic versus indirecta y polysynaptic. Un estándar de oro para hacer esta distinción en las neuronas mamíferas es medir la latencia entre action potentials solo en las células presinápticas y la aparición de corrientes postsinápticas excitatorias (EPSCs) en la segunda neurona. Conexiones monosynaptic deben tener latencias cortas de unos pocos milisegundos y baja variabilidad³. Este enfoque puede ser complicado en invertebrados neuronas porque las sinapsis pueden ocurrir en sus dendritas lejos del sitio de grabación somáticos, provocando retrasos en la detección debido a las distancias largas electrotónicos entre conductancias postsinápticas y la grabación electrodo. Estos retrasos pueden introducir ambigüedad con respecto a poli-versus contribuciones monosynaptic. Además, pequeños eventos sinápticos puede decaer antes de llegar a la página grabaciones somática y conducir la actividad presináptica más fuerte, es probables que contratar eventos polysynaptic.

Han desarrollado varias técnicas para probar las conexiones monosynaptic en invertebrados. Un método utiliza soluciones de cationes divalentes alta (Hi-Di) que contiene exceso de magnesio⁺⁺ y Ca⁺⁺. Esta solución bloquea conexiones polysynaptic reduce probabilidad de liberación y aumento umbral potencial de acción a favor de la detección de monosynaptic entrada^4,5. Determinar la proporción exacta de Mg^{++ ++} de CA requiere, sin embargo, no es trivial y polysynaptic contribuciones pueden persistir incluso modesta estimulación⁶. Un enfoque alternativo denominado reconstitución GFP a través de socios sináptica (GRASP) aprovecha la proximidad entre las membranas previas y postsinápticas en sinapsis para inferir una conexión monosynaptic ⁷. Aquí, un componente de la proteína verde fluorescente (GFP) se expresa en una neurona, y el fragmento complementario de la molécula se expresa en un supuesto socio postsináptico. La presencia de fluorescencia indica que las dos neuronas están lo suficientemente cerca para permitir la reconstitución de la molécula GFP e implica la existencia de sinapsis. ASIMIENTO puede Informe sinapsis falso, sin embargo, si dos celdas han estrechamente apposed membranas, como en un nervio o fascículo. Variantes del asimiento de eliminan tales falsos positivos por atar el presináptico fragmento de GFP directamente a synaptobrevin, permitiendo así la reconstitución solamente en sinapsis activa⁸. Mientras que asimiento y sus variantes han sido instrumentales en la determinación de conectividad funcional en la Drosophila del CNS, algunas conexiones pueden no hacerse visibles por comprensión si las distancias entre los socios pre- y postsinápticas es relativamente grande. Esto es particularmente pertinente en la evaluación de la transmisión de volumen asociada a neuromodulación⁹ o GABAérgicas inhibición¹⁰.

Aquí, se demuestra una técnica complementaria y novedosa para probar conexiones monosynaptic directas en Drosophila del CNS. Este método, llamado tetrodotoxina resistencia diseñado para sondeo sinapsis (TERPS), funciona por la coexpresión de la tetrodotoxina (TTX)-canal sodio resistente, NaChBac y un activador de optogenetic en una célula presináptica durante la grabación de la supuesta socios postsynaptic⁹. En presencia de TTX, se suprime toda actividad mediada por el potencial de acción en células distintas de las que NaChBac. El canal de NaChBac selectivamente restaura la excitabilidad en las celdas presinápticos específicos, permitiendo la transmisión sináptica evocada por la luz. Este método permite la fuerte activación de las neuronas presinápticas, tal que las conexiones se pueden resolver postsynaptically somática grabación mientras reduce la probabilidad de contratar circuitos polysynaptic. Importante, esta técnica permite el estudio de la transmisión de volumen y revela la difusión del transmisor liberado de una sola neurona a lo largo de un circuito. Además, los TERPS puede revelar la naturaleza química de la conexión a través de la farmacología convencional. TERPS es conveniente para el uso en cualquier modelo de sistema que permite la expresión transgénica de los canales de sodio TTX-insensible.