دراسة اتصالات مونوسينابتيك في المورفولوجية استخدام مقاومة تيدرودوتاكسين صوديوم قنوات
Summary
هذه المقالة ميزات أسلوب اختبار اتصالات مونوسينابتيك بين الخلايا العصبية باستخدام تيدرودوتاكسين والقناة تيدرودوتاكسين-مقاومة الصوديوم، ناتشباك.
Abstract
هنا، يتم تطبيق تقنية جديدة تسمى “المقاومة تيتروتوكسين” (ت) إجراء هندسة عكسية ل Synapses السبر (تيربس) لاختبار اتصالات مونوسينابتيك بين الخلايا العصبية المستهدفة. يعتمد الأسلوب على التعبير المشارك من المنشط المحورة وراثيا مع قناة الصوديوم تيدرودوتاكسين المقاوم، ناتشباك، في خلية presynaptic محددة. اتصالات مع الشركاء بعد متشابك المفترضة التي تحددها تسجيلات كامل الخلية حضور ت، الذي يمنع النشاط الكهربائي في الخلايا العصبية التي لا تعبر عن ناتشباك. يمكن تعديل هذا النهج للعمل مع أي منشط أو تصوير الكالسيوم كمراسل للاتصالات. ويضيف تيربس إلى مجموعة متنامية من الأدوات المتاحة لتحديد الاتصال داخل الشبكات. ومع ذلك، تيربس فريدة من نوعها في ذلك تقارير موثوق بها أيضا السائبة أو نقل وحدة التخزين ونقل الفائض.
Introduction
هدفا رئيسيا لعلم الأعصاب خريطة الاتصالات بين الخلايا العصبية لفهم كيفية تدفق المعلومات من خلال الدوائر. أصبحت العديد من النهج والموارد المتاحة لاختبار اتصال وظيفية بين الخلايا العصبية في مجموعة من الأنظمة النموذجية1،2. لإنشاء الرسوم البيانية الأسلاك الأكثر دقة باستخدام الكهربية، من المهم حل سواء كانت اتصالات الملحوظ بين خليتين مونوسينابتيك مقابل بوليسينابتيك وغير المباشرة وغير المباشرة. معيار الذهب لجعل هذا التمييز في الثدييات من الخلايا العصبية لقياس زمن الوصول بين action potentials واحد في الخلايا presynaptic وظهور التيارات بوستسينابتيك ضادات (ابسكس) في الخلايا العصبية الثانية. يجب أن يكون اتصالات مونوسينابتيك الاختفاء قصيرة بضع ميلي ثانية وتقلب منخفضة3. هذا النهج يمكن أن يكون معقداً في اللافقاريات الخلايا العصبية لأنه قد تحدث الاشتباكات العصبية في dendrites بهم بعيداً عن الموقع تسجيل جسدية، مما يؤدي إلى تأخير في الكشف عن سبب مسافات طويلة اليكتروتونيك بين كوندوكتانسيس بوستسينابتيك والتسجيل قطب كهربائي. يمكن إدخال هذه التأخيرات الغموض فيما يتعلق ببولي-مقابل الاشتراكات مونوسينابتيك. بالإضافة إلى ذلك، الأحداث متشابك الصغيرة قد تسوس قبل الوصول إلى الموقع تسجيلات جسدية، وقيادة النشاط presynaptic أقوى، من المرجح أن تجنيد الأحداث بوليسينابتيك.
وقد وضعت تقنيات مختلفة لاختبار اتصالات مونوسينابتيك في اللافقاريات. نهج واحد يستخدم الأيونات الموجبة divalent عالية الحلول (مرحبا دي) التي تحتوي على فائض ملغ++ وكاليفورنيا++. يمنع هذا الحل الاتصالات بوليسينابتيك باحتمال الإفراج عن الحد وزيادة إمكانات العمل عتبة لصالح كشف الإدخال مونوسينابتيك4،5. تحديد نسبة دقة ملغ++ بكاليفورنيا++ المطلوبة، ومع ذلك، ليست تافهة، وقد تستمر الاشتراكات بوليسينابتيك لتحفيز متواضعة حتى6. نهج بديل يسمى “إعادة تشكيل” التجارة والنقل عبر الشركاء متشابك (فهم) يستفيد من القرب بين الأغشية قبل وبوستسينابتيك عثر عليها في نهايات للاستدلال اتصال مونوسينابتيك 7. هنا، وأعرب عن مكون البروتينات الفلورية الخضراء (التجارة والنقل) في إحدى الخلايا العصبية، ويعبر عن جزء مكمل للجزيء بشريك بوستسينابتيك المفترضة. وجود الأسفار يشير إلى أن الخلايا العصبية اثنين في قرب قريبة ما يكفي للسماح بإعادة تشكيل جزيء بروتينات فلورية خضراء وينطوي على وجود المشبك. فهم يمكن تقرير نهايات زورا، رغم ذلك، إذا خليتين عن كثب قد الرئيسي يعارضها الأغشية، كما هو الحال في أحد الأعصاب أو كراسة. المتغيرات لفهم القضاء على هذه المغلوطة بالربط الجزء بريسينابتيك من التجارة والنقل مباشرة إلى سينابتوبريفين، مما يتيح إعادة تشكيل فقط في نهايات نشط8. في حين قد ساعدت في تحديد الربط الوظيفي في المورفولوجية CNS فهم وعن المتغيرات، بعض قد لا إجراء اتصالات مرئية بفهم إذا كانت المسافات بين الشركاء قبل وبوستسينابتيك كبيرة نسبيا. وهذا ذات الصلة لا سيما في تقييم نقل وحدة التخزين المرتبطة نيورومودوليشن9 أو تثبيط جابايرجيك10.
هنا، هو أظهر تقنية تكميلية ورواية لاختبار اتصالات مونوسينابتيك مباشرة في المورفولوجية الجهاز العصبي المركزي. يعمل هذا الأسلوب، تسمى “المقاومة تيدرودوتاكسين إجراء هندسة عكسية” لسبر سينابسيس (تيربس)، حسب تعبير المشاركين عن تيدرودوتاكسين (ت)-قناة مقاومة الصوديوم، ناتشباك، ومنشط أوبتوجينيتيك في خلية presynaptic أثناء التسجيل من المفترضة الشركاء بوستسينابتيك9. حضور ت، يتم منع جميع إمكانات العمل بوساطة النشاط في الخلايا غير تلك التي تعرب عن ناتشباك. قناة ناتشباك بشكل انتقائي يعيد استثارة في الخلايا المستهدفة presynaptic، تسمح بانتقال متشابك أثارت الضوء. هذا الأسلوب يسمح التنشيط قوية من الخلايا العصبية presynaptic، مثل أن اتصالات يمكن أن تحلها بوستسينابتيكالي تسجيل جسدية مع الحد من احتمال توظيف الدوائر بوليسينابتيك. الأهم من ذلك، هذا الأسلوب يسمح بدراسة حجم الإرسال ويكشف عن انتشار الإرسال صدر من خلية واحدة في جميع أنحاء دائرة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تكشف عن تيربس الطبيعة الكيميائية للاتصال من خلال الأدوية التقليدية. تيربس غير مناسبة للاستخدام في أي نموذج النظام يتيح التعبير المحورة وراثيا من قنوات الصوديوم ت غير متحسسة.
Protocol
Representative Results
Discussion
تحليل تيربس تكمل التقنيات الحالية المستخدمة لحلبة تكسير بتمكين الكشف عن نقاط الاشتباك العصبي بين الخلايا العصبية التي تم تحديدها. على وجه التحديد، النهج الذي يكشف عن اتصالات مونوسينابتيك بإسكات إمكانات العمل مع تتكس على نطاق واسع أثناء استعادة استثارة في عدد سكان تحديد الخلايا العصبية ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر جوشوا سنجر، جوناثان شينك، فضلا عن المراجعين مدروس للتعليقات على المخطوطة. كما نود أن نشكر بن الأبيض وهارولد الجريدة للمناقشات بشأن الأسلوب. شينك جوناثان توفر البيانات الشكل 3A. أيد هذا العمل على منحة من مؤسسة وايت هول و R21 المعاهد الوطنية للصحة إلى قج.
Materials
| UAS-csChrimson | Bloomington Drosophila Stock Center | 55135 | Used as a neural activator |
| UAS-NaChBac | Bloomington Drosophila Stock Center | 9466 | Resotores excitibility in cells in TTX |
| Tetrodotoxin | Tochris | 1078 | Special permission may be needed to purchase TTX as it is a controlled substance |
| all trans-Retinal | Sigma-Aldrichall trans-Retinal | R2500 | Require co-factor for channelrhodopsin |
| Weldable 321 Stainless Steel Sheet, 0.002" Thick, 10" Wide | McMaster Carr | 3254K7 | Used to make custom fly holder. Custom foil can be laser cut at pololu.com from the provided PDF file |
| Dissection Microscope | Zeiss | Stemi 2000-C | Used for dissection of preparation |
| Waxer | Almore | Eectra Waxer 66000 | Used during dissection to secure fly in foil |
| Paraffin Wax | Joann | 4917217 | Used with waxer |
| Number 5 forceps | Fine Science Tools | #5CO | Used for dissection and desheathing |
| Dissection Scissors | Fine Science Tools | 15001-08 | Used to remove parts of the cuticle during dissection |
| Tungsten wire | A-M Systems | 797500 | Use with electrolysis to make sharpened needles for dissection |
| Reciculating Peristaltic Pump | Simply Pumps (Amazon) | PM200S | for recirculating TTX |
| Speed Controller for peristaltic pump | Zitrades (Amazon) | N/A | PWM Dimming Controller For LED Lights or Ribbon, 12 Volt 8 Amp,Adjustable Brightness Light Switch Dimmer Controller DC12V 8A 96W for Led Strip Light B |
| Versa-Mount Precision Compressed Air Regulator | McMaster Carr | 1804T1 | For applying positive pressure during patching |
| Glass capilaries | World Precision Instruments | TW150F-3 | For patch pipettes |
| Multipurpose Gauge | McMaster Carr | 3846K431 | Gauge for pressure regulator |
| Electrophysiology Camera | Dage MTI | IR-1000 | Any camera that works in the IR range (850 nm) will work. You do not want to use red illumination as this can activate csChrimson |
| IR LED | Thorlabs | M850F2 | For oblique illumination |
| fiber optic for IR LED | Thorlabs | M89L01 | Couples to IR LED |
| Objective lens | Olympus 40X | LUMPlanFLN | This can be used on most microscipes and works well for visualizing fly neurons. |
| Amber LED | Thorlabs | M590L3d | For visualizing RFP and mCherry |
| Blue LED | Thorlabs | M470L3d | For visualizing GFP |
| GFP filter set | Chroma | 49011 | For visualizing GFP or stimulating channel2rhodopsin |
| Custom mCherry Filter Set | Chroma | et580/25x and t600lpxr (from the 49306 set) but with an et610lp barrier/emission optic | Use only if you wish to patch identified neurons with channel2rhodopsin |
| Dichroic to combine Amber and blue LED | Thorlabs | DMLP550R | Use only patch under mCherry and excite channel2rhodopsin with blue light. |
| Red LED | LEDSupply | Cree XPE 620 – 630 nm | Used to drive csChrimson |
| LED Driver | LEDSupply | 3021-D-E-1000 | Used to drive LEDs for optogenetic stimulation |
| Manipulator | Sutter Instruments | MP-225 | Used to position pipette during recordings |
| Patchclamp Amplifier | A-M Systems | Model 2400 | An equivalent amplifier is suitable |
| Bessel Filter | Warner Instruments | LPF 202A | Auxillary filter used to filter current trace to oscilloscope during patching. |
| Data Acquisition System | National Instruments | NI PCIe-6321 781044-01 | Used to record data from amplifier to computer |
| Connector Block – BNC Terminal BNC-2090A | National Instruments | 779556-01 | Used to connect amplifier to DAQ card. |
| Steel Foil | McMaster Carr | 3254K7 | Steel foil for custom recording chamber |
| Magnets | K&J Magnetics | D42 | To secure recording chamber to ring stand |
| 1/16" Cell Cast Acrylic Clear | Pololu | Used to make custom recording chamber. Acrylic can be laser cut at pololu.com from the provided PDF file |
References
- Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections. Nat Neurosci. 10, 663-668 (2007).
- Yao, Z., Macara, A. M., Lelito, K. R., Minosyan, T. Y., Shafer, O. T. Analysis of functional neuronal connectivity in the Drosophila brain. J Neurophysiol. , 684-696 (2012).
- Doyle, M. W., Andresen, M. C. Reliability of monosynaptic sensory transmission in brain stem neurons in vitro. J Neurophysiol. 85, 2213-2223 (2001).
- Nicholls, J. G., Purves, D. Monosynaptic chemical and electrical connexions between sensory and motor cells in the central nervous system of the leech. J Physiol-London. 209, 647-667 (1970).
- Byrne, J. H., Castellucci, V. F., Kandel, E. R. Contribution of individual mechanoreceptor sensory neurons to defensive gill-withdrawal reflex in Aplysia. J Neurophysiol. 41, 418-431 (1978).
- Liao, X., Walters, E. T. The use of elevated divalent cation solutions to isolate monosynaptic components of sensorimotor connections in Aplysia. J Neurosci Meth. 120, 45-54 (2002).
- Feinberg, E. H., et al. GFP Reconstitution Across Synaptic Partners (GRASP) Defines Cell Contacts and Synapses in Living Nervous Systems. Neuron. 57, 353-363 (2008).
- Macpherson, L. J., et al. Dynamic labelling of neural connections in multiple colours by trans-synaptic fluorescence complementation. Nat Commun. 6, 10024-10029 (2015).
- Zhang, X., Gaudry, Q. Functional integration of a serotonergic neuron in the Drosophila antennal lobe. Elife. 5, (2016).
- Wilson, R. I. Early olfactory processing in Drosophila: mechanisms and principles. Annu Rev Neurosci. 36, 217-241 (2013).
- Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nat Methods. 11, 338-346 (2014).
- Murthy, M., Turner, G. C. Whole-cell in vivo patch-clamp recordings in the Drosophila brain. Cold Spring Harb Protoc. , 140-148 (2013).
- Murthy, M., Turner, G. C. Dissection of the head cuticle and sheath of living flies for whole-cell patch-clamp recordings in the brain. Cold Spring Harb Protoc. 2013, 134-139 (2013).
- Gu, H., O’Dowd, D. K. Whole Cell Recordings from Brain of Adult Drosophila. J Vis Exp. , (2007).
- Wilson, R. I., Turner, G. C., Laurent, G. Transformation of olfactory representations in the Drosophila antennal lobe. Science. 303, 366-370 (2004).
- Kazama, H., Wilson, R. I. Homeostatic Matching and Nonlinear Amplification at Identified Central Synapses. Neuron. 58, 401-413 (2008).
- Becnel, J., et al. DREADDs in Drosophila: a pharmacogenetic approach for controlling behavior, neuronal signaling, and physiology in the fly. Cell Reports. 4, 1049-1059 (2013).
- Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand. P Natl Acad Sci USA. 104, 5163-5168 (2007).
- Sun, Q. Q., Wang, X., Yang, W. Laserspritzer: A Simple Method for Optogenetic Investigation with Subcellular Resolutions. PLoS One. 9, e101600-e101608 (2014).
- Holloway, B. B., et al. Monosynaptic Glutamatergic Activation of Locus Coeruleus and Other Lower Brainstem Noradrenergic Neurons by the C1 Cells in Mice. J Neurosci. 33, 18792-18805 (2013).
- Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. The subcellular organization of neocortical excitatory connections. Nature. 457, 1142-1145 (2009).
- Kloppenburg, P., Ferns, D., Mercer, A. R. Serotonin enhances central olfactory neuron responses to female sex pheromone in the male sphinx moth manduca sexta. J Neurosci. 19, 8172-8181 (1999).
- Suster, M. L., Seugnet, L., Bate, M., Sokolowski, M. B. Refining GAL4-driven transgene expression in Drosophila with a GAL80 enhancer-trap. Genesis. 39, 240-245 (2004).
