Examinant les connexions monosynaptiques chez la drosophile en utilisant des canaux sodiques tétrodotoxine résistant

Un objectif majeur des neurosciences consiste à mapper les connexions entre les neurones pour comprendre comment l’information circule à travers des circuits. Nombreuses approches et les ressources sont devenues disponibles pour tester la connectivité fonctionnelle entre les neurones dans une gamme de systèmes de modèle^1,2. Pour générer les schémas de câblage plus précis à l’aide d’électrophysiologie, il est important de résoudre si connexions observées entre deux cellules sont directs et monosynaptique versus indirecte et polysynaptiques. Un étalon-or pour faire cette distinction dans les neurones chez les mammifères est de mesurer la latence entre unique action potentials dans les cellules présynaptiques et l’apparition de courants postsynaptiques excitateurs (EPSCs) dans le deuxième neurone. Connexions monosynaptiques devraient avoir courts temps de latence de quelques millisecondes et faible variabilité³. Cette approche peut être compliquée dans les neurones d’invertébrés comme les synapses peuvent être chez leurs dendrites loin du site d’enregistrement somatique, provoquant des retards dans la détection en raison des distances longues électrotonique entre conductances postsynaptiques et l’enregistrement électrode. Ces retards peuvent introduire des ambiguïté concernant poly-par rapport aux cotisations monosynaptiques. En outre, petits événements synaptiques peut se désintégrer avant d’atteindre le site d’enregistrements somatique et conduire plus forte activité présynaptique, est susceptibles de recruter des événements polysynaptiques.

Diverses techniques ont été développés pour tester les connexions monosynaptiques chez les invertébrés. Une approche utilise des solutions de haute cation divalent (Hi-Di) contenant des excès de Mg⁺⁺ et Ca⁺⁺. Cette solution bloque les connexions polysynaptiques par probabilité de libération réductrice et croissant seuil de potentiel d’action pour favoriser la détection de monosynaptique entrée^4,5. Déterminer le rapport précis entre la Mg⁺⁺ ca⁺⁺ nécessaire, cependant, n’est pas trivial et polysynaptiques contributions peuvent persister pendant une stimulation même modeste⁶. Une approche alternative appelée Reconstitution GFP entre partenaires synaptiques (GRASP) profite de la proximité entre les membranes préalables et postsynaptiques trouvé au niveau des synapses d’inférer une connexion monosynaptique ⁷. Ici, une composante de la protéine fluorescente verte (GFP) s’exprime dans un neurone, et le fragment complémentaire de la molécule est exprimé dans un partenaire postsynaptique putatif. La présence de fluorescence indique que les deux neurones sont très suffisamment proches pour permettre la reconstitution de la molécule GFP et implique l’existence d’une synapse. GRASP peut signaler les synapses faussement, cependant, si deux cellules ont étroitement accolées des membranes, comme dans un nerf ou fascicules. Variantes du GRASP éliminent ces faux positifs en attachant le fragment présynaptique de GFP directement à synaptobrévine, permettant ainsi la reconstitution qu’au synapses actives⁸. Tandis que le GRASP et ses variantes ont grandement contribués à établir la connectivité fonctionnelle chez la drosophile CNS, certaines connexions ne peuvent pas rendues visibles par emprise si les distances entre les partenaires de pré- et post-synaptiques est relativement importante. Ceci est particulièrement pertinent dans l’évaluation de la transmission de volume associée à la neuromodulation⁹ ou de l’inhibition GABAergique¹⁰.

Ici, une technique nouvelle et complémentaire est démontrée pour tester les connexions directes de monosynaptiques chez la drosophile CNS. Cette méthode, appelée tétrodotoxine Engineered résistance pour sonder Synapses (TERPS), fonctionne par la co-expression de la tétrodotoxine (TTX)-canal sodique résistant, NaChBac et un activateur d’optogenetic dans une cellule présynaptique pendant l’enregistrement de putatif partenaires postsynaptique⁹. En présence de TTX, toute l’activité induite par le potentiel d’action est supprimée dans les cellules autres que celles exprimant NaChBac. Le canal de NaChBac restaure sélectivement excitabilité dans les cellules présynaptiques ciblées, permettant la transmission synaptique évoquée par la lumière. Cette méthode permet de forte activation des neurones présynaptiques, telles que les connexions peuvent être résolues postsynaptique par somatique enregistrement tout en réduisant la probabilité de recrutement circuits polysynaptiques. Ce qui est important, cette technique permet l’étude de la transmission de volume et révèle la propagation du transmetteur libéré d’un neurone unique tout au long d’un circuit. En outre, les TERPS peut révéler la nature chimique de la connexion par le biais de pharmacologie traditionnelle. TERPS est adapté pour une utilisation dans n’importe quel système de modèle qui permet l’expression transgénique des canaux de sodium insensibles à la TTX.