Behandeling van Monosynaptic verbindingen in Drosophila met behulp van resistente tetrodotoxine natrium kanalen

Een belangrijk doel van de neurowetenschappen is om de verbindingen tussen neuronen te begrijpen hoe informatie stroomt door schakelingen in kaart. Talrijke benaderingen en middelen zijn beschikbaar om te testen voor functionele verbindingen tussen neuronen in een waaier van model systemen^1,2gekomen. Voor het genereren van de meest nauwkeurige schakelschema’s met behulp van electrofysiologie, is het belangrijk om op te lossen of waargenomen verbindingen tussen twee cellen directe en monosynaptic versus indirecte en polysynaptic zijn. Een gouden standaard voor het maken van dit onderscheid in zoogdieren neuronen is voor het meten van de latentie tussen enkele action potentials in de presynaptische cellen en het begin van excitatory postsynaptisch stromingen (EPSCs) in het tweede neuron. Monosynaptic verbindingen moeten korte latencies voor een paar milliseconden en lage variabiliteit³. Deze aanpak kan worden gecompliceerd in ongewervelde neuronen omdat synapsen op in hun dendrites ver van de somatische opname site treedt, veroorzaakt door vertragingen in de opsporing als gevolg van lange electrotonic afstanden tussen postsynaptisch conductances en de opname elektrode. Dergelijke vertragingen kunnen leiden tot dubbelzinnigheid over poly-versus monosynaptic bijdragen. Bovendien, kleine synaptic gebeurtenissen kan verval alvorens de site somatische opnames en rijden sterker presynaptische activiteit, dreigt te werven van polysynaptic evenementen.

Diverse technieken zijn ontwikkeld om te testen voor monosynaptic verbindingen in ongewervelden. Een benadering gebruikt hoge divalente kationen oplossingen (Hi-Di) met overtollige Mg⁺⁺ en Ca⁺⁺. Deze oplossing blokkeert polysynaptic verbindingen op vermindering release waarschijnlijkheid en toenemende actiepotentiaal drempel om de gunst van de detectie van monosynaptic input^4,5. Bepaling van de precieze verhouding van Mg⁺⁺ aan Ca⁺⁺ vereist, echter, is niet triviaal en zelfs bescheiden stimulatie⁶polysynaptic bijdragen kunnen aanhouden. Een alternatieve benadering genaamd GFP reconstitutie in Synaptic Partners (greep) maakt gebruik van de nabijheid tussen pre-en postsynaptisch membraan gevonden op synapsen afleiden een monosynaptic verbinding ⁷. Hier, een onderdeel van de groen fluorescente proteïne (GFP) wordt uitgedrukt in een neuron en de aanvullende fragment van het molecuul wordt uitgedrukt in een vermeende postsynaptisch partner. De aanwezigheid van fluorescentie geeft aan dat de twee neuronen zijn genoeg dicht bij toestaan reconstitutie van het GFP-molecuul en impliceert het bestaan van een synaps. GREEP kunt melden synapsen ten onrechte, hoewel, als twee cellen hebben nauw apposed membranen, zoals in een zenuw of fascicle. Varianten van greep elimineren deze valse positieven door het binden van de presynaptische fragment van GFP rechtstreeks naar synaptobrevin, waardoor de reconstitutie alleen op actieve synapsen⁸. Terwijl greep en zijn varianten instrumentaal zijn bij het bepalen van de functionele connectiviteit in de Drosophila CNS, kunnen sommige verbindingen niet zichtbaar worden gemaakt door greep als de afstanden tussen de pre- en postsynaptisch partners is relatief groot. Dit is vooral relevant bij de beoordeling van volume transmissie neuromodulatie⁹ of¹⁰remming GABAergic zijn gekoppeld.

Hier blijkt een complementaire en nieuwe techniek voor het testen van directe monosynaptic verbindingen in de Drosophila CNS. Deze methode, genaamd tetrodotoxine Engineered weerstand voor indringende Synapses (kerken), werkt door co uitdrukking van de tetrodotoxine (TTX)-resistente natrium-kanaal, NaChBac en een optogenetic activator in een presynaptische cel tijdens het opnemen van vermeende postsynaptisch partners⁹. In aanwezigheid van de TTX, wordt alle actiepotentiaal-gemedieerde activiteit onderdrukt in cellen dan die uiting van NaChBac. Het NaChBac kanaal herstelt selectief prikkelbaarheid in de gerichte presynaptische cel(len), synaptische transmissie licht-opgeroepen het toelaat. Deze methode maakt sterke activering van de presynaptische neuronen, zodanig dat verbindingen postsynaptically kunnen worden opgelost door somatische opname terwijl het verminderen van de kans op polysynaptic schakelingen te werven. Nog belangrijker is, is deze techniek maakt de studie van volume transmissie en onthult de verspreiding van zender vrijgelaten uit een enkel neuron in een circuit. Bovendien kan de kerken de chemische aard van de verbinding via conventionele farmacologie onthullen. KERKEN is geschikt voor gebruik in elk modelsysteem waarmee de transgene uitdrukking van TTX-ongevoelig natrium kanalen.