Examinando Monosynaptic conexões em drosófila usando os canais de sódio tetrodotoxina resistente

Dos principais objetivos da neurociência é mapear as conexões entre os neurônios para entender como a informação flui através de circuitos. Inúmeros recursos e abordagens tornaram-se disponíveis para testar a conectividade funcional entre os neurônios em uma variedade de sistemas de modelo^1,2. Para gerar os diagramas de fiação mais precisos usando eletrofisiologia, é importante resolver se observadas as conexões entre duas células são diretos e monosynaptic versus indireta e polysynaptic. Um padrão de ouro para fazer esta distinção nos neurônios de mamíferos é medir a latência entre action potentials único nas células pré-sináptica e o aparecimento de correntes pós-sináptico excitatórios (EPSCs) no segundo neurônio. Monosynaptic conexões devem ter latências curtas de alguns milissegundos e baixa variabilidade³. Essa abordagem pode ser complicada em neurônios invertebrados porque sinapses podem ocorrer em suas dendrites, longe de ser o local de gravação somática, causando atrasos na deteção devido tempo electrotonic distâncias entre conductances pós-sinápticos e a gravação eletrodo. Esses atrasos podem introduzir ambiguidade poli-contra contribuições monosynaptic. Além disso, pequenos eventos sinápticos podem deteriorar antes de chegar ao local de gravações somática e dirigindo mais forte atividade pré-sináptica, é prováveis que recrutar polysynaptic eventos.

Várias técnicas têm sido desenvolvidas para testar conexões monosynaptic em invertebrados. Uma abordagem utiliza as soluções de alta cátion divalente (Hi-Di) contendo excesso Mg +⁺ e Ca +⁺. Esta solução bloqueia conexões polysynaptic por redução de lançamento de probabilidade e limiar de ação potencial crescente para favorecer a deteção de entrada monosynaptic^4,5. Determinar a proporção precisa de Mg Ca +⁺ +⁺ necessário, no entanto, não é trivial e contribuições polysynaptic podem persistir por estimulação mesmo modesto⁶. Uma abordagem alternativa, chamada reconstituição GFP entre parceiros sináptica (alcance) aproveita a proximidade entre as membranas pré e pós-sinápticas encontrado em sinapses para inferir uma conexão monosynaptic ⁷. Aqui, um componente da proteína verde fluorescente (GFP) é expresso em um neurônio, e o fragmento complementar da molécula é expresso em um parceiro pós-sináptica putativo. A presença de fluorescência indica que os dois neurônios estão em proximidade suficiente para permitir a reconstituição da molécula GFP e implica a existência de uma sinapse. ALCANCE pode relatar sinapses falsamente, no entanto, se duas células estreitamente tem Aposto membranas, como em um nervo ou Fascículo. Variantes de alcance eliminam tais falsos positivos por amarrar o fragmento pré-sináptica de GFP diretamente para synaptobrevin da, permitindo assim a reconstituição somente às sinapses ativo⁸. Enquanto compreensão e suas variantes têm sido fundamentais para determinar a conectividade funcional na drosófila CNS, algumas conexões podem não ser feitas visíveis pelo alcance se as distâncias entre parceiros pré e pós-sinápticas é relativamente grande. Isto é particularmente pertinente na avaliação da transmissão de volume associado a neuromodulação⁹ ou de inibição GABAérgica¹⁰.

Aqui, uma técnica complementar e romance é demonstrada para testar conexões diretas de monosynaptic no CNS da drosófila . Esse método, chamado tetrodotoxina engenharia resistência para sondar as sinapses (TERPS), trabalha pela expressão co da tetrodotoxina (TTX)-canal de sódio resistente, NaChBac e um ativador de optogenetic em uma célula pré-sináptica durante a gravação de putativo parceiros pós-sináptica⁹. Na presença de TTX, toda a atividade mediada por potencial de ação é suprimida em células diferentes dos expressando NaChBac. O canal NaChBac restaura seletivamente excitabilidade na célula pré-sináptica alvo, permitindo a transmissão sináptica luz-evocada. Este método permite forte ativação dos neurônios pré-sináptica, tal que as conexões podem ser resolvidas pós-sinapticamente pela gravação somática, reduzindo a probabilidade de recrutamento de circuitos polysynaptic. Importante, esta técnica permite o estudo da transmissão de volume e revela a propagação do transmissor liberado de um único neurônio ao longo de um circuito. Além disso, TERPS pode revelar a natureza química da conexão através de farmacologia convencional. TERPS é adequado para uso em qualquer modelo de sistema que permite a expressão transgênica da diferenciação de TTX canais de sódio.