הגברה איזותרמי מרובבת מבוסס פלטפורמת אבחון לאיתור Zika Chikungunya, קדחת דנגה 1

זיהומים וירוס בעקיצות יתוש, לרבות קדחת דנגה, chikungunya Zika וירוסים הם על אסטרטגיות הניהול המיידית עלייה וביקוש. קדחת דנגה וירוסים chikungunya אנדמיים כבר רבות של האזורים הטרופיים איפה Zika מתפשטת עכשיו חצי הכדור המערבי¹. וירוס Zika, כמו קדחת דנגה, חבר של משפחת Flaviviridae , הוא יליד אפריקה עם אחד אסיה אפריקה שושלות גנטיות שני². אף-על-פי זיהוי הווירוס Zika שתחילתה 1947, Zika זיהום בבני נשאר סדיר במשך מאה וחצי לפני המתעוררים באוקיינוס השקט, אמריקה. פרוץ המדווחת הראשונה Zika חום אירעה על האי של הפה, מיקרונזיה בשנת 2007, ואחריו פולינזיה הצרפתית 2013 ו- 2014. ההתפרצות הראשונה הגדולות ביבשת אמריקה אירעה בשנת 2015 בברזיל.

Zika chikungunya, קדחת דנגה וירוסים מועברים בעיקר על ידי Aedes aegypti אדס מפוספס. עם זאת, Zika בעל אפשרויות שידור נוספים אדם אל אדם במורד הזרם, צפויה להתפשט דרך מגע מיני, אינטראקציה אמא-כדי-העובר, ולא באמצעות הנקה^3,4,5. קדחת Zika האמינו תחילה כדי לגרום למחלה קלה בלבד. עם זאת, זה היה אח כ הקשורים עם תסמונת גיליאן במבוגרים, microcephaly neonates, במחלות כרוניות השלד והשרירים אולי חודשים עד שנים. אבחון של מחלה Zika עשויה להיות מאתגרת, מאז הסימפטומים של זיהום Zika דומים לאלה של אחרים נגד יתושים-התפשטות וירוסים⁶. זיהומים נפוצים שיתוף של וירוסים אלה הפוך אבחנות יותר מאתגר^7,8. לכן, זיהוי מהיר ואמין חומצות גרעין מפני Zika ווירוסים אחרים יש צורך להבין אפידמיולוגיה בזמן אמת, כדי ליזום אמצעי מניעה ובקרה, ניהול הטיפול בחולה⁹.

בדיקות אבחון הנוכחי עבור וירוסים אלה כוללים בדיקות סרולוגית, בידוד וירוס, וירוס רצף הפוכה-תמלול PCR (RT-PCR). גישות סרולוגית רגיל סובלים לעתים קרובות רגישות לקוי, תוצאות יכול להיות מסובך אשיג בחולים שנדבקו בעבר על ידי אחרים flaviviruses.

לכן, בדיקות חומצות גרעין נשאר הדרך האמינה ביותר ויוכל להבדיל וירוסים אלה. זיהוי של Zika ווירוסים אחרים בעקיצות יתושים מתבצעת בדרך כלל באמצעות RT-PCR או בזמן אמת RT-PCR במגוון הביולוגי נוזלים, כמו סרום, השתן, רוק, זרע, חלב ו- נוזל מוחי^10,11. דגימות שתן ורוק עדיפים בדרך כלל על דם, מאחר שהם מייצגים פחות PCR-עיכוב, מטענים נגיפי גבוה יותר, נוכחות וירוס עבור תקופות זמן ארוכות יותר וקלות מוגברת של איסוף וטיפול^12,13. RT-PCR מבוססי בדיקות אבחון, עם זאת, מהווים צעדים הכנה דגימה נרחבת, ציוד רכיבה על אופניים תרמי יקר, עושה את זה פחות אופטימלי בשלב של הטיפול.

שעתוק במהופך בתיווך לופ הגברה איזותרמי (RT-המנורה) התפתחה בתור חלופה RT-PCR חזק בשל רגישות גבוהה שלה ירידה לפרטים¹⁴, שלה עמידות לחומרים מעכבות בביולוגית דגימות¹⁵, ו מבצע על טמפרטורה יחיד, אשר באופן משמעותי assay מפחית את המורכבות ואת עלויות, שהופך אותו מתאים לסביבות משאבים נמוכה. RT-המנורה, כמו זה מיושם באופן קלאסי, מונה שישה צבעי יסוד זה לאגד שמונה אזורים הנבדלים זה מזה בטווח המטרה RNA. זה פועל בטמפרטורות מתמדת בין 60 ° C ו- 70 מעלות צלזיוס, ומשתמש של רוורס טרנסקריפטאז, של ה-DNA פולימראז עם חוט חזק ועקרו מבתיהם פעילות.

במהלך בשלבים ההתחלתיים של RT-המנורה, קדימה ואחורה פנימי תחל (FIP, ביפ, איור 1A) יחד עם תחל קדימה ואחורה החיצוני (F3 ו- B3) יוצרות מבנה המשקולת, מבנה הזרע הגברה המנורה מעריכית. הגברה נוספת מואץ על ידי הלולאה קדימה ואחורה תחל (אם ו LB), אשר נועדו לקשור אזורים נטושים יחיד המשקולת, תוצאות על היווצרות concatemers עם חוזרים מרובים לולאות¹⁶. המנורה קלאסית מבחני בהתבסס על עכירות או הבדיקה על ידי ה-DNA intercalating צבע הוא לא לגמרי מתאים עבור זיהוי בשלב של טיפול Zika, איפה רמה מסוימת של ריבוב הרצוי^17,18,19. ריבוב לא בקלות מתקבל במערכות אלו, כפי שהם נוטים ליצור שווא-תוצאות חיוביות בשל ביטול-יעד amplifications.

כדי לנהל את הסוגיות הללו, הספרות מוסיפה מרכיב חשוב נוסף בדמות “החללית ועקרו מבתיהם strand” קלאסית RT-המנורה אדריכלות^20,21,22. כל בדיקה יש אזור כפול-strand רצף ספציפי, אזור חד גדילי לקרקע. החללית עם האזור חד גדילי המתויגת של 5′-fluorophore, החללית משלימים משתנה עם כ’חטיף 3′-end. בהעדר מטרה, אין קרינה פלואורסצנטית הוא ציין עקב הכלאה של גדילים משלימים בדיקה, אשר מביא את fluorophore ואת כ’חטיף לתוך קרבה. בנוכחות מטרה, החלק חד גדילי של החללית פלורסנט נקשר המשלים שלו על המטרה ולאחר מכן נמתח חוט ועקרו מבתיהם פולימראז. הארכה נוספת פולימראז מאת תחל הפוך גורם ההפרדה של סטרנד כ’חטיף מ שלה strand fluorescently שכותרתו משלימים, המאפשר פליטת קרינה פלואורסצנטית (איור 1B). עם העיצוב הזה, האות נוצר לאחר היווצרות המשקולת, להפחית את הסיכויים של אותות חיובי-false.

החלק גדילי כפול של החללית ועקרו מבתיהם סטרנד יכול להיות כל רצף, כאשר ריבוב מוחל, ניתן להשתמש באותו הרצף עם fluorophore שונים-כ’חטיף זוגות. זו ארכיטקטורה, השתן נגוע וירוסים, סרום או יתוש דגימות זחלים וחרקים על נייר הוכנסו ישירות הבדיקה ללא הכנת הדוגמא. הקריאות תלת-צבעי זריחה גלויים לעין האנושית נוצרו בתוך 30-45 דקות, אותות היו דמיינו ידי תיבה תצפית מודפס 3D משתמש LED כחול של מסנן כתום. ליופיליזציה ריאגנטים RT-המנורה איפשרה פריסה של הקיט הזה כדי להוריד את הגדרות משאבים ללא צורך קירור.