Gemultiplexten isothermen Verstärkung basiert Diagnoseplattform zu erkennen, Zika, Chikungunya und Dengue-Fieber 1

Moskitos übertragene Virus-Infektionen, einschließlich Dengue-Fieber, Chikungunya und Zika Viren sind auf den Aufstieg und Nachfrage sofortige Managementstrategien. Dengue-Fieber und Chikungunya-Fieber-Viren sind bereits in vielen tropischen Regionen denen Zika jetzt in der westlichen Hemisphäre¹verbreitet ist endemisch. Zika-Virus, wie Dengue-Fieber, ist ein Mitglied der Familie Flaviviridae und stammt aus Afrika mit einem asiatischen und zwei afrikanische genetische Linien². Obwohl die Identifizierung des Virus Zika bis 1947 zurückgeht, blieb Zika-Infektion beim Menschen sporadisch für ein halbes Jahrhundert vor der Schwellenländer in den Pazifik und Amerika. Der erste gemeldete Ausbruch der Zika-Fieber auf der Insel Yap in den Föderierten Staaten von Mikronesien im Jahr 2007 trat gefolgt von Französisch-Polynesien in 2013 und 2014. Der erste große Ausbruch auf dem amerikanischen Kontinent ereignete sich im Jahr 2015 in Brasilien.

Zika, Chikungunya und Dengue-Fieber-Viren sind in erster Linie von Aedes Aegypti und Aedes Albopictusübertragen. Zika hat jedoch zusätzliche nachgeschaltete Mensch-zu-Mensch-Übertragungsmöglichkeiten, wahrscheinlich, zu verbreiten, durch sexuellen Kontakt, Mutter-Fötus-Interaktion, und über^3,4,5stillen. Zika Fieber glaubte zunächst nur milde Krankheit verursachen. Jedoch wurde es später im Zusammenhang mit Guillain-Barré-Syndrom bei Erwachsenen, Mikrozephalie bei Neugeborenen und chronischen Erkrankungen des Bewegungsapparates, die letzten Monate bis Jahre. Zika Erkrankung kann schwierig sein, da die Symptome einer Zika-Infektion ähnlich denen von anderen Mücke verbreitete Viren-^{6 sind}. Allgemeine Coinfektion dieser Viren machen Differentialdiagnose noch schwieriger^7,8. Daher braucht man schnelle und zuverlässige Detektion von Nukleinsäuren von Zika und andere Viren Epidemiologie in Echtzeit, um Kontrolle und vorbeugende Maßnahmen zu initiieren und Patientenversorgung⁹verwalten zu verstehen.

Aktuelle diagnostische Tests für diese Viren sind serologische Tests, die Virusisolierung, Virus-Sequenzierung und Reverse Transkription PCR (RT-PCR). Serologische Standardansätze leiden oft unzureichende Sensitivität und Ergebnisse können durch Kreuzreaktivität bei Patienten, die zuvor von anderen Flaviviren infiziert wurden, erschwert werden.

Daher bleibt die Nukleinsäure-Tests der zuverlässigste Weg zu erkennen und diese Viren zu unterscheiden. Erkennung von Zika und andere Moskitos übertragene Viren erfolgt in der Regel mittels RT-PCR oder Real-Time RT-PCR in unterschiedlichsten biologischen Flüssigkeiten, wie z. B. Serum, Urin, Speichel, Sperma, Muttermilch und zerebralen Fluid^10,11. Urin und Speichel Proben werden über Blut, in der Regel bevorzugt, da sie zeigen weniger PCR-Hemmung, höheren Viruslast, Virus-Präsenz für längere Zeit und erhöhte Benutzerfreundlichkeit der Sammlung und Bearbeitung von^12,13. RT-PCR-basierten diagnostischen Tests, umfassen jedoch umfangreiche Stichprobe Vorbereitungsschritte und teure thermische Rad-Ausrüstung, so dass es weniger optimal für den Point-of-Care.

Reversen Transkription Schleife-vermittelten isothermen Verstärkung (RT-Lampe) als eine leistungsfähige RT-PCR-Alternative aufgrund seiner hohen Sensitivität und Spezifität^{14 entstanden}, seine Toleranz für hemmende Stoffe in biologischen Proben¹⁵, und Betrieb auf single-Temperatur deutlich senkt die Komplexität und die damit verbundenen Kosten, eignet sich für Umgebungen mit geringen Ressourcen assay. RT-Lampe, da sie klassisch umgesetzt wird, besteht aus sechs Primer, die an acht verschiedenen Regionen innerhalb der Ziel-RNA binden. Es läuft bei konstanten Temperaturen zwischen 60 ° C und 70 ° C, und verwendet eine Reverse Transkriptase und einer DNA-Polymerase mit starken Strang Aktivität verdrängen.

In der Anfangsphase des RT-Lampe bilden vorwärts und rückwärts interne Primer (FIP und BIP, Abb. 1A) zusammen mit äußeren vorwärts und rückwärts Primer (F3 und B3) eine Hantel Struktur, die Samen der exponentiellen Amplifikation der Lampe. Verstärkung wird weiter beschleunigt durch die Schleife vorwärts und rückwärts Primer (LF und LB), die entworfen sind, um die einzelnen gestrandeten Regionen der Hantel zu binden, und führt zur Bildung von Concatemers mit mehreren sich wiederholenden Schleifen¹⁶. Klassische Lampe Tests basierend auf Trübung oder Auslesen von DNA verschuppen Farbstoffe ist nicht ganz geeignet für Point-of-Care-Erkennung von Zika, wo gewisse multiplexing ist^17,18,19gewünscht. Multiplex ist nicht leicht in diesen Systemen erhalten sind anfällig für Fehlalarme durch Ziel-Vergrößerungen erzeugen.

Um diese Probleme zu verwalten, hinzugefügt die Literatur der klassischen RT-Lampe Architektur^20,21,22eine zusätzliche Komponente in Form einer “Strang verdrängen Sonde”. Jede Sonde verfügt über eine Sequenz-spezifische Doppel-Strang-Region und eine einsträngige Priming-Region. Die Sonde mit der einzelsträngigen Region ist mit einer 5′-Fluorophor markiert, und die ergänzenden Sonde ist mit einem 3′-Ende Quencher modifiziert. In Ermangelung eines Ziels wird keine Fluoreszenz durch Hybridisierung der ergänzenden Sonde Stränge beobachtet bringt das Fluorophor und Durstlöscher in unmittelbarer Nähe. In Anwesenheit eines Ziels der einsträngige Teil der fluoreszierenden Sonde bindet mit seinem Komplement auf das Ziel und wird dann durch einen Strang verdrängen Polymerase verlängert. Polymerase-Erweiterung durch reverse Primer bewirkt, dass die Trennung des Teilprogramms Durstlöscher aus seine komplementäre Eindringmittel beschrifteten Strang, so dass Emission von FluoreszenzAbbildung 1 b() (). Mit diesem Design wird das Signal nach der Hantel-Bildung, wodurch die Chancen von falsch-positiven Signale generiert.

Die doppelsträngige Teil des Prüfpunkts Strang verdrängen kann beliebiger Reihenfolge, und wenn Multiplexen angewendet wird, die gleiche Reihenfolge verwendet werden, mit verschiedenen Fluorophor-Quencher Paaren. Mit dieser Architektur, Virus kontaminiert Urin, Serum oder Moskito wurden Proben zerquetscht auf Papier direkt an der Assay ohne Probenvorbereitung eingeführt. Dreifarben Fluoreszenz Auslesen für menschliche Auge sichtbar waren innerhalb von 30-45 min generiert und Signale wurden durch ein 3D-gedruckten Beobachtung-Feld, das eine blaue LED und einen Orangefilter verwendet visualisiert. Gefriertrocknung die RT-Lampe Reagenzien ermöglicht Bereitstellung dieses Kits Ressourceneinstellungen ohne Kühlung zu senken.