Multiplexed isotherme amplificatie gebaseerd diagnostische Platform om te detecteren Zika, Chikungunya en Dengue 1

Muggen overgebrachte virusinfecties, met inbegrip van Zika-virus, dengue en chikungunya zijn op de opkomst en vraag onmiddellijk beheersstrategieën. Dengue en chikungunya virussen zijn al endemisch in veel van de tropische gebieden waar Zika nu in het westelijk halfrond¹zich verspreidt. Zika virus, zoals dengue, deel uitmaakt van de Flavivirus -familie en is inheems in Afrika met een Aziatische en twee Afrikaanse genetische lineages². Hoewel de identificatie van de Zika-virus uit 1947 dateert, bleef Zika infectie bij de mens sporadische voor een halve eeuw vóór de opkomst in de Stille Oceaan en Amerika. De eerste gemelde uitbraak van Zika koorts vond plaats op het eiland Yap in de Federale Staten van Micronesia in 2007, gevolgd door Frans-Polynesië in 2013 en 2014. De eerste grote uitbraak in Amerika vond plaats in 2015 in Brazilië.

Zika, dengue en chikungunya virussen zijn vooral overgedragen door Aedes aegypti en Aedes albopictus. Zika heeft echter extra downstream mens-tot-mens transmissie mogelijkheden, waarschijnlijk wordt verspreid via seksueel contact, moeder-naar-foetus interactie, en via de borstvoeding^3,4,5. Zika koorts werd voor het eerst geloofde alleen milde ziekte veroorzaken. Het was echter later Guillain-Barré syndroom bij volwassenen, microcefalie in pasgeborenen en chronische spier-en ziekten die laatste maanden tot jaren kunnen zijn gekoppeld. Diagnose van Zika ziekte kan lastig zijn, omdat de symptomen van een infectie Zika vergelijkbaar met die van andere mug-spread virussen^{6 zijn}. Voorkomende co-infecties van deze virussen maken differentiële diagnose nog grotere uitdaging^7,8. Snelle en betrouwbare detectie van de nucleïnezuren van Zika en andere virussen is daarom nodig om te begrijpen van de epidemiologie in real-time, bij het starten van de controle- en preventiemaatregelen, en het beheren van patiëntenzorg⁹.

Huidige diagnostische tests voor deze virussen omvatten serologische tests, isolatie van het virus, virus sequencing en omgekeerde-transcriptie PCR (RT-PCR). Standaard serologische benaderingen vaak lijden aan ontoereikende gevoeligheid en resultaten kunnen worden bemoeilijkt door Kruisallergie bij patiënten die eerder zijn door andere flavivirussen besmet.

Nucleïnezuur testen blijft daarom de meest betrouwbare manier om te ontdekken en te onderscheiden van deze virussen. Detectie van Zika en andere door muggen overgebrachte virussen wordt meestal uitgevoerd met behulp van de RT-PCR of RT-PCR in real time in verscheidenheid van biologische vloeistoffen, zoals serum, urine, speeksel, sperma, moedermelk en cerebrale vloeistof^10,11. Urine en speeksel monsters zijn over het algemeen de voorkeur over bloed, omdat zij vertonen minder PCR-inhibitie, hogere virale belasting, virus aanwezigheid voor langere tijd, en het verhoogde gebruiksgemak verzamelen en verwerken van^12,,¹³. RT-PCR-gebaseerde diagnostische tests, bestaat echter uit uitgebreide steekproef voorbereiding stappen en dure thermische fietsen apparatuur, waardoor het minder optimaal voor de point-of-care.

Omgekeerde transcriptie lus-gemedieerde isotherme amplificatie (RT-LAMP) heeft ontpopt als een krachtige RT-PCR alternatief vanwege de hoge gevoeligheid en specificiteit¹⁴, zijn tolerantie voor remmende stoffen in biologische monsters¹⁵, en werking op interne temperatuur, die aanzienlijk verlaagt assay complexiteit en bijkomende kosten, waardoor het geschikt is voor omgevingen met lage resource. RT-LAMP, omvat zoals het klassiek wordt uitgevoerd, zes inleidingen die zich aan acht verschillende regio’s binnen het doeldocument RNA binden. Het draait bij een constante temperatuur tussen 60 ° C en 70 ° C, en gebruikt een reverse-transcriptase en een polymerase van DNA met sterke strand verdringt activiteit.

Tijdens de eerste stadia van de RT-LAMP vormen voorwaartse en achterwaartse interne inleidingen (FIP en BIP, figuur 1A) samen met de buitenste voorwaartse en achterwaartse inleidingen (F3 en B3) een halter-structuur, de zaad-structuur van de exponentiële versterking van de LAMP. Versterking verder wordt versneld door de lus voorwaartse en achterwaartse inleidingen (LF en LB), die zijn ontworpen om het binden van de enkele gestrande regio’s van de halter, en resulteert in de vorming van concatemers met meerdere herhalende lussen¹⁶. Klassieke LAMP testen op basis van troebelheid of uitlezing door DNA intercalating kleurstoffen is niet geheel geschikt voor point-of-care detectie van Zika, waar sommige multiplexing is gewenst^17,18,19. Multiplex is niet gemakkelijk verkregen in deze systemen, zoals ze gevoelig zijn voor het genereren van vals-positieven te wijten aan uit-target amplifications.

Voor het beheren van deze kwesties, wordt extra materiaal in de vorm van een “deel-verdringt probe” in de literatuur toegevoegd aan de klassieke RT-LAMP het platform^20,21,22. Elke sonde heeft een reeks specifieke dubbele-strand en een single-stranded priming-regio. De sonde met de single-stranded regio is gelabeld met een 5′-fluorophore, en de aanvullende sonde wordt gewijzigd met een quencher van 3′-eind. Bij gebrek aan een doel, wordt geen fluorescentie waargenomen als gevolg van de kruising van de strengen van complementaire sonde, waardoor de fluorophore en de quencher in de nabijheid. In aanwezigheid van een doel, het single-stranded gedeelte van de fluorescente sonde bindt aan het complement op de doelgroep, en vervolgens door een strand verdringt polymerase is uitgebreid. Verdere uitbreiding van de polymerase door omgekeerde inleidingen zorgt ervoor dat de scheiding van het quencher deel van haar aanvullende fluorescently geëtiketteerde strand, waardoor de uitstoot van fluorescentie ()figuur 1B). Met dit ontwerp, wordt het signaal gegenereerd na de vorming van de halter, vermindering van de kans op vals-positieve signalen.

Het double-stranded gedeelte van de sonde strand-verdringt kan een willekeurige tekenreeks, en wanneer multiplexing wordt toegepast, dezelfde volgorde kan worden gebruikt met verschillende fluorophore-quencher-paren. Met deze het platform, virus-besmette urine, serum of mug kennisgemaakt monsters squished op papier rechtstreeks met de bepaling zonder bereiding van de monsters. Drie kleuren fluorescentie read-outs zichtbaar voor het menselijk oog werden gegenereerd binnen 30-45 min en signalen waren gevisualiseerd door een 3D-gedrukte observatie-box die gebruikmaakt van een blauwe LED en een oranje filter. Trekkers van de RT-LAMP reagentia ingeschakeld implementatie van deze kit te verlagen van broninstellingen zonder behoefte aan koeling.