Multiplexado amplificação isotérmica com base em plataforma de diagnóstica para detectar Dengue 1, Chikungunya e Zika

Infecções por vírus transmitidas por mosquitos, inclusive da dengue e chikungunya Zika vírus são sobre as estratégias de gestão imediata de ascensão e a demanda. Vírus da dengue e chikungunya já são endêmicas em muitas das regiões tropicais onde Zika está se espalhando no hemisfério ocidental¹. Zika vírus, como a dengue, é um membro da família Flaviviridae e é nativa da África com um asiático e duas linhagens genéticas africanas². Mesmo que a identificação do vírus Zika remonta a 1947, Zika infecção em humanos permaneceu esporádica há meio século antes de emergir no Pacífico e nas Américas. O primeiro surto relatado de Zika febre ocorreu na ilha de Yap, nos Estados Federados da Micronésia, em 2007, seguido de Polinésia francesa em 2013 e 2014. O primeiro grande foco nas Américas ocorreu em 2015 no Brasil.

Vírus da dengue, chikungunya e Zika são transmitidos principalmente pelo Aedes aegypti e Aedes albopictus. No entanto, Zika tem possibilidades adicionais a jusante transmissão de humano para humano, provavelmente sendo espalhadas através do contato sexual, interação mãe-para-feto e através do aleitamento materno^3,4,5. Zika febre primeiro foi acreditado para causar doença apenas suave. No entanto, mais tarde foi associado com a síndrome de Guillain-Barré em adultos, microcefalia em recém-nascidos e crônicas doenças músculo-esqueléticas que podem últimos meses a anos. Diagnóstico de doença Zika pode ser um desafio, uma vez que os sintomas de uma infecção Zika são semelhantes de outros vírus de propagação do mosquito⁶. Co-infecções comuns destes vírus fazem diagnóstico diferencial ainda mais desafiador^7,8. Portanto, deteção rápida e confiável dos ácidos nucleicos de Zika e outros vírus é necessária para compreender a epidemiologia em tempo real, para iniciar o controle e medidas preventivas e para gerenciar o atendimento ao paciente⁹.

Testes de diagnóstico atual para estes vírus incluem testes serológicos, isolamento do vírus, sequenciamento do vírus e PCR transcrição reversa (RT-PCR). Abordagens serológicas padrão muitas vezes sofrem de sensibilidade inadequada e resultados podem ser complicados por reatividade cruzada em pacientes que anteriormente foram infectados por outros flavivírus.

Portanto, o teste de ácido nucleico continua a ser a maneira mais confiável para detectar e diferenciar estes vírus. Deteção de Zika e outros vírus transmitidas por mosquitos é geralmente realizada usando RT-PCR ou RT-PCR em tempo real em uma variedade de fluidos biológicos, tais como soro, urina, saliva, sêmen, leite materno e fluido cerebral^10,11. Amostras de urina e saliva são geralmente preferidas sobre sangue, uma vez que eles apresentam menos PCR-inibição, cargas virais, presença de vírus por longos períodos de tempo e maior facilidade de coleta e tratamento de^12,13. Testes de diagnóstico baseados em RT-PCR, no entanto, compreendem as etapas de preparação de amostra extensa e caro equipamento de ciclismo térmico, tornando-se menos ideal para o local de tratamento.

Transcrição reversa mediada por loop de amplificação isotérmica (RT-lâmpada) surgiu como uma poderosa alternativa de RT-PCR, devido à sua alta sensibilidade e especificidade¹⁴,¹⁵, amostras de sua tolerância para substâncias inibidoras no biológico e operação em temperatura única, que significativamente reduz do ensaio de complexidade e custos associados, tornando-o adequado para ambientes de baixo recurso. RT-lâmpada, como classicamente é implementada, compreende seis primeiras demão que ligam a oito regiões distintas dentro da meta do RNA. Ele é executado em temperaturas constantes entre 60 ° C e 70 ° C e usa um transcriptase reversa e uma DNA polimerase com forte vertente deslocando atividade.

Durante os estágios iniciais do RT-lâmpada, avançar e retroceder internas Cartilhas (FIP e BIP, figura 1A) juntamente com o exterior para a frente e para trás as primeiras demão (F3 e B3) formam uma estrutura de haltere, a estrutura de sementes de amplificação exponencial de lâmpada. Amplificação é ainda mais acelerada por laço frente e para trás primers (LF e LB), que são projetados para ligar as regiões encalhadas única do haltere, e resulta na formação de concatemers com repetindo vários loops¹⁶. Ensaios de lâmpada clássica baseada na turbidez ou leitura por DNA intercalante corantes não é inteiramente adequada para deteção de point-of-care de Zika, onde algum nível de multiplexação é desejado^17,18,19. Multiplexação não é facilmente obtida nestes sistemas, como eles são propensos a gerar falsos positivos devido amplificações fora do alvo.

Para gerenciar essas questões, a literatura adiciona um componente adicional sob a forma de uma “fio-deslocando sonda” para a arquitetura RT-lâmpada clássica^20,21,22. Cada teste possui uma sequência específica dobro-costa e uma região de single-stranded escorva. A sonda com a região de single-stranded é marcada com um fluoróforo 5′, e a sonda complementar é modificada com um quencher 3′-extremidade. Na ausência de um alvo, sem fluorescência é observada devido a hibridação das vertentes complementares sonda, que traz o fluoróforo e quencher em estreita proximidade. Na presença de um alvo, a parte single-stranded da sonda fluorescente vincula seu complemento no alvo e então é estendida por um fio, deslocando a polimerase. Nova prorrogação de polimerase por primers reversos provoca a separação da strand quencher de sua cadeia complementar fluorescente etiquetada, permitindo a emissão de fluorescência (figura 1B). Com este projeto, o sinal é gerado após a formação do haltere, reduzindo as chances de sinais falso-positivos.

A porção de dupla-hélice da vertente-deslocando sonda pode ser qualquer sequência, e quando a multiplexação é aplicada, a mesma sequência pode ser utilizada com pares diferentes fluoróforo-quencher. Com esta arquitetura, urina contaminada por vírus, soro ou mosquito esmagadas no papel de amostras foram introduzidas diretamente o ensaio sem preparação da amostra. Leituras de três cores fluorescência visíveis ao olho humano foram geradas dentro de 30-45 min, e os sinais foram visualizados por uma caixa de observação 3D-impresso que utiliza um LED azul e um filtro laranja. Os reagentes de RT-lâmpada de liofilização habilitado a implantação deste kit para diminuir as configurações de recursos sem a necessidade de refrigeração.