La amplificación isotérmica multiplexada basado en plataforma de diagnóstico para detectar Zika, Chikungunya y Dengue 1

Infecciones de virus transmitidos por mosquitos, incluyendo Zika virus, dengue y chikungunya son en las estrategias de manejo inmediato de aumento y la demanda. Dengue y chikungunya virus ya son endémicos en muchas de las regiones tropicales donde Zika ahora se extiende en el hemisferio occidental¹. Zika virus, como el dengue, es un miembro de la familia Flaviviridae y es nativo a África con un asiático y dos linajes genéticos africanos². A pesar de la identificación del virus Zika se remonta a 1947, Zika infección en seres humanos seguía siendo esporádica por medio siglo antes de emerger en el Pacífico y las Américas. El primer brote reportado de Zika fiebre se produjo en la isla de Yap, en los Estados federados de Micronesia en 2007, seguido de la Polinesia francesa en 2013 y 2014. El primer brote importante en las Américas ocurrió en el año 2015 en Brasil.

Zika, chikungunya y dengue virus son transmitidos principalmente por Aedes aegypti y Aedes albopictus. Sin embargo, Zika tiene posibilidades de transmisión de humano a humano adicionales aguas abajo, es probable que se propague a través del contacto sexual, interacción de la madre al feto y a través de la lactancia materna^3,4,5. La fiebre Zika primero se cree que causan sólo leves. Sin embargo, más tarde fue asociada con el síndrome de Guillain-Barré en adultos, microcefalia en recién nacidos y las enfermedades musculoesqueléticas crónicas que pueden durar meses a años. Diagnóstico de enfermedad de Zika puede ser difícil, ya que los síntomas de una infección de Zika son similares a los de otros virus mosquito-extensión⁶. Las coinfecciones comunes de estos virus hacen diagnóstico diferencial más difícil^7,8. Por lo tanto, la detección rápida y confiable de los ácidos nucleicos de Zika y otros virus es necesario para comprender la epidemiología en tiempo real, para iniciar medidas preventivas y control y para gestionar la atención de los pacientes⁹.

Pruebas de diagnóstico actuales para estos virus incluyen pruebas serológicas, aislamiento viral, secuenciación de virus y transcripción reversa PCR (RT-PCR). Estándar métodos serológicos a menudo sufren de sensibilidad insuficiente y resultados pueden ser complicados por reactividad cruzada en pacientes que previamente han sido infectados por otros flaviviruses.

Por lo tanto, pruebas de ácido nucleico sigue siendo la forma más confiable para detectar y diferenciar estos virus. Detección de Zika y otros virus transmitidos por mosquitos se realiza generalmente mediante RT-PCR o RT-PCR en tiempo real en gran variedad de fluidos biológicos, como suero, orina, saliva, semen, leche materna y líquido cerebral^10,11. Las muestras de orina y la saliva se prefiere generalmente sobre sangre, puesto que exhiben menos inhibición de la polimerización en cadena, cargas virales más altas, presencia de virus por largos períodos de tiempo y aumento de la facilidad de recolección y manejo de^12,13. Pruebas diagnósticas basadas en RT-PCR, sin embargo, conforman la muestra extenso y caro equipamiento ciclismo térmico, haciéndolo menos óptima para el punto de atención.

Muestras de su tolerancia de sustancias inhibidoras en biológico y reversa de la transcripción mediada por el bucle de amplificación isotérmica (RT-LAMP) ha surgido como una poderosa alternativa de RT-PCR debido a su alta sensibilidad y especificidad¹⁴,¹⁵, y operación de temperatura individual, que significativamente ensayo de baja complejidad y los costos asociados, lo que es adecuado para entornos de bajos recursos. RT-LAMP, como clásicamente se implementa, consta de seis cartillas que se unen a ocho regiones distintas dentro de la meta de RNA. Funciona en temperaturas constantes entre 60 ° C y 70 ° C y utiliza una transcriptasa inversa y una ADN polimerasa con filamento fuerte desplazando la actividad.

Durante las etapas iniciales de RT-LAMP, hacia adelantados y hacia atrás interiores imprimaciones (FIP y BIP, figura 1A) junto con cartillas externas hacia adelantados y hacia atrás (F3 y B3) forman una estructura de la pesa de gimnasia, la estructura de la semilla de la amplificación exponencial de lámpara. Amplificación es aún más acelerada por el lazo hacia adelante y hacia atrás cartillas (LF y LB), que están diseñados para enlazar las regiones solo trenzadas de la pesa de gimnasia, y resultados en la formación de concatemers con la repetición de múltiples lazadas¹⁶. LÁMPARA clásica de ensayos basado en turbidez o lectura por ADN intercalando tintes no es totalmente adecuado para detección de punto de atención de Zika, donde es cierto nivel de multiplexación había deseado^17,18,19. Multiplexing no es fácilmente obtenido en estos sistemas, ya que son propensos a generar falsos positivos debido a amplificaciones de fuera de objetivo.

Para gestionar estos temas, la literatura agrega un componente adicional en la forma de una “sonda desplace el filamento” a la clásica lámpara RT arquitectura^20,21,22. Cada sondeo tiene una región de doble cadena de secuencia-específicas y una región sola cebado. La sonda con la región monocatenario es etiquetada con un fluoróforo de 5′, y la sonda complementaria se modifica con un extintor de extremo 3′. En la ausencia de un objetivo, ninguna fluorescencia se observa debido a la hibridación de los filamentos complementarios de la sonda, que trae el fluoróforo y el quencher en proximidad cercana. En presencia de un objetivo, la sola porción de la sonda fluorescente se une a su complemento en el destino y luego se extiende por un filamento desplazando polimerasa. Extensión adicional de la polimerasa por cartillas inversas provoca la separación del quencher filamento de su filamento fluorescente etiquetado complementario, permitiendo la emisión de fluorescencia ()figura 1B). Con este diseño, la señal es generada después de la formación pesa de gimnasia, reduciendo las posibilidades de las señales de falsos positivos.

La porción de la doble hebra de la sonda desplace el filamento puede ser cualquier secuencia, y cuando se aplica la multiplexación, la misma secuencia puede utilizarse con pares de diferentes fluoróforo-quencher. Con esta arquitectura, contaminados por el virus de la orina, suero o mosquito muestras aplastadas en el papel fueron introducidas directamente en el ensayo sin preparación de la muestra. Lectura de la fluorescencia tricolor visible para el ojo humano se generaron dentro de 30-45 min, y señales fueron visualizadas por un cuadro de observación impreso en 3D que utiliza un LED azul y un filtro naranja. Liofilización de los reactivos de RT-LAMP permitió el despliegue de este kit para bajar la configuración de recursos sin necesidad de refrigeración.