L’Amplification isotherme multiplexée selon plate-forme diagnostique pour détecter Zika, Chikungunya et Dengue 1

Infections à virus transmises par les moustiques, y compris virus Zika, chikungunya et la dengue sont sur les stratégies de prise en charge immédiate de montée et de la demande. Virus de la dengue et le chikungunya sont déjà endémiques dans nombreuses régions tropicales où Zika se répand maintenant dans l’ hémisphère occidental¹. Zika virus, comme la dengue, est membre de la famille des Flaviviridae et est originaire d’Afrique avec un asiatique et deux lignées génétiques africaine². Même si l’identification du virus Zika remonte à 1947, Zika infection chez l’homme est restée sporadique pendant un demi-siècle avant d’émerger dans le Pacifique et les Amériques. La première épidémie signalée de Zika fièvre s’est produite sur l’île de Yap dans les États fédérés de Micronésie, en 2007, suivie de la Polynésie Français en 2013 et 2014. La première épidémie majeure dans les Amériques a eu lieu en 2015 au Brésil.

Virus Zika, chikungunya et la dengue sont transmis principalement par Aedes aegypti et Aedes albopictus. Cependant, Zika a les possibilités de transmission de humain en aval supplémentaire, probablement, se réparties par contact sexuel, l’interaction mère-à-foetus et via l’allaitement^3,4,5. Zika fièvre pensait tout d’abord à provoquer une maladie bénigne seulement. Cependant, il fut plus tard associée à syndrome de Guillain-Barré chez l’adulte, une microcéphalie chez les nouveau-nés et des maladies musculo-squelettiques chroniques qui peuvent le mois derniers à ans. Diagnostic de la maladie de Zika peut être difficile, étant donné que les symptômes d’une infection de Zika sont semblables à celles des autres virus moustique-propagation⁶. Co-infections communes de ces virus font Diagnostics différentiels, encore plus difficile^7,8. Par conséquent, la détection rapide et fiable des acides nucléiques de Zika et d’autres virus est nécessaire pour comprendre épidémiologie en temps réel, d’engager des mesures préventives et contrôle et de gérer les soins aux patients,⁹.

Les tests de diagnostic actuels pour ces virus incluent des tests sérologiques, isolement du virus, virus séquençage et PCR de transcription inverse (RT-PCR). Des procédures types sérologiques souffrent souvent de sensibilité insuffisante et résultats peuvent être compliquées par réaction croisée chez les patients qui ont déjà été infectés par les autres flavivirus.

Test de dépistage reste donc le moyen le plus fiable pour détecter et différencier ces virus. Détection de Zika et autres virus transmissibles par le moustique est généralement réalisée à l’aide de RT-PCR ou RT-PCR en temps réel dans une variété de liquides biologiques, comme le sérum, urine, salive, sperme, le lait maternel et le liquide cérébral^10,11. Échantillons d’urine et la salive sont généralement préférés au sang, puisqu’ils montrent moins de PCR-inhibition, une charge virale supérieure, présence de virus pour des périodes plus longues et une facilité accrue de prélèvement et de manipulation de^12,13. Tests de diagnostic à base de RT-PCR, toutefois, comprennent des étapes de préparation d’échantillon vaste et coûteux équipement cyclisme thermique, rendant moins optimal pour le point-of-care.

Transcription inverse amplification isotherme boucle-négociée (RT-lampe) a émergé comme une alternative de RT-PCR puissante grâce à sa haute sensibilité et spécificité¹⁴, sa tolérance pour des substances inhibitrices dans biological samples¹⁵, et opération sur la température unique, qui a considérablement réduit dosage complexité et les coûts connexes, adapté aux environnements de faibles ressources. RT-lampe, telle qu’elle est implémentée classiquement, comprend six amorces qui se lient aux huit régions distinctes au sein de l’ARN cible. Il fonctionne à des températures constantes entre 60 ° et 70 ° C et utilise une transcriptase inverse et une ADN polymérase avec fil fort déplacement de l’activité.

Pendant les premières étapes de RT-lampe, amorces internes avant et arrière (FIP et BIP, Figure 1 a) avec des amorces avant et arrière extérieures (F3 et B3) forment une structure de l’haltère, la structure de la graine d’amplification exponentielle de lampe. L’amplification est encore accélérée par les boucle avant et en arrière des amorces (LF et LB), qui visent à lier les régions simples brin de l’haltère, et conduit à la formation de concatémères répétés plusieurs boucles¹⁶. Turbidité basée sur des analyses de lampe classique ou affichage par ADN intercalant colorants n’est pas tout à fait adapté pour détection de point-of-care de Zika, où certains niveau de multiplexage est désiré^17,18,19. Multiplexage par répartition n’est pas facilement obtenu dans ces systèmes, car ils sont susceptibles de générer des faux positifs en raison de l’amplification hors cible.

Pour gérer ces questions, la littérature ajoute une composante supplémentaire sous la forme d’une « sonde de brin-déplacement » à la RT-lampe classique architecture^20,21,22. Chaque sonde est une région de double-brin de séquence-spécifique et une région simple brin d’amorçage. La sonde avec la région monocaténaire est étiquetée avec un fluorophore 5′, et la sonde complémentaire est modifiée avec un extincteur d’extrémité 3′. En l’absence d’une cible, aucune fluorescence n’est observée en raison de l’hybridation des brins complémentaires de sonde, qui apporte le fluorophore et extincteur à proximité. En présence d’une cible, la portion monocaténaire de la sonde fluorescente se lie à son effectif sur la cible et est ensuite étendue par un brin déplaçant polymérase. Prolongation de polymérase amorces inverse provoque la séparation du brin désactivateur de son brin complémentaire fluorescent étiqueté, permettant l’émission de fluorescence (Figure 1 b)) . Grâce à cette conception, le signal est généré après la formation de l’haltère, réduisant les chances de signaux de faux-positifs.

La partie double-brin de la sonde strand-déplacement peut être une séquence et multiplexage est appliqué, la même séquence peut-être être utilisée avec les paires différentes fluorophore-extincteur. Avec cette architecture, urine contaminée par le virus, sérum ou moustique échantillons écrasés sur papier ont été introduits directement à l’essai sans préparation de l’échantillon. Afficheurs de fluorescence trois couleurs visibles à le œil humain ont été obtenues dans les 30-45 min, des signaux ont été visualisés par une boîte d’observation imprimés 3D qui utilise une LED bleue et un filtre orange. Lyophilisation les réactifs de RT-lampe a permis le déploiement de ce kit pour abaisser les paramètres des ressources sans besoin de réfrigération.