Applicazione del sistema di coltura Explant Aorta-gonade-Mesonefro nell'ematopoiesi inerente allo sviluppo
Summary
Questo protocollo descrive l’utilizzo coltivate Aorta-gonade-Mesonephros per analisi di espressione, unità formanti colonia in cultura e milza e ricostituzione a lungo termine per determinare l’effetto di fattori regolatori e vie di segnalazione su staminali ematopoietiche sviluppo delle cellule. Questo è stato dimostrato come un sistema efficace per lo studio della funzione e biologia delle cellule staminali ematopoietiche.
Abstract
La limitazione dell’utilizzo di embrioni di topo per studi di ematopoiesi è l’inconveniente aggiunto nelle operazioni, che è in gran parte dovuto lo sviluppo intrauterino dell’embrione. Anche se sono convincenti dati genetici da topi knockout (KO), non è realistico per generare topi KO per i geni tutti come necessario. Inoltre, esibendosi in vivo gli esperimenti di salvataggio per consolidare i dati ottenuti da topi KO non è conveniente. Per superare queste limitazioni, la cultura di espianto Aorta-gonade-Mesonephros (AGM) è stata sviluppata come un sistema appropriato per studiare lo sviluppo di cellule staminali ematopoietiche (HSC). Soprattutto per gli esperimenti di salvataggio, può essere utilizzato per recuperare l’ematopoiesi alterata in topi KO. Con l’aggiunta di prodotti chimici appropriati nel mezzo, la segnalazione alterata può essere riattivata o vie di up-regolato possono essere inibite. Con l’uso di questo metodo, molti esperimenti possono essere eseguite per identificare i regolatori critici dello sviluppo di HSC, compreso HSC correlati espressione genica a livelli di mRNA e proteina, capacità di formazione di Colonia e la capacità di ricostituzione. Questa serie di esperimenti sarebbe utile nel definire i meccanismi di fondo essenziali per lo sviluppo di HSC nei mammiferi.
Introduction
Cellule staminali ematopoietiche (HSCs) sono cellule staminali adulte tessuto-specifici che possiedono multilineare potenziale compreso degli eritrociti, mieloidi e cellule linfoidi come pure la capacità di auto-rinnovarsi. Recenti studi hanno dimostrato che i primi HSCs è sorto da una popolazione endoteliale specializzata, nota come endotelio hemogenic (HE), attraverso l’endoteliale di transizione ematopoietico (EHT) presso la parete ventrale dell’aorta dorsale1,2 ,3,4. Una volta formato regione aorta-gonade-mesonephros (AGM) da embrionali (E) 10.5 a 12.5 in embrione di topo, HSCs migrare nel fegato fetale per espansione e infine colonizzare il midollo osseo per mantenere l’ematopoiesi adulto per tutta la vita di un individuo 5 , 6. anche se questo è stato studiato per molti anni, i meccanismi di fondo di HSC emersione e sviluppo rimangono in modo incompleto capiti.
A differenza di fecondazione in vitro e sviluppo di embrioni di zebrafish, lo sviluppo intrauterino degli embrioni del mouse rende lo studio dell’emopoiesi definitiva durante l’embriogenesi molto più scomodo. Anche se gli esperimenti genetici, utilizzando topi knockout (KO) sono comunemente utilizzati, la mancanza di alcuni topi KO anche limita il loro uso nel campo della ricerca ematopoietico. Inoltre, in vivo gli esperimenti di salvataggio non sono facilmente eseguiti nei topi KO. Dal 1996, la cultura di espianto AGM è stata sviluppata per gli studi ematopoietici dai pionieri nel campo7. Con l’aiuto di questo sistema di coltura, tessuti ventrale della regione AGM sono stati identificati per promuovere attività HSC, mentre tessuti dorsale esercitano un opposto effetto8,9. Il sistema di coltura explant AGM è stato applicato anche per determinare i ruoli di serotonina, Mpl, SCF, BMP e Hedgehog signaling in HSC sviluppo10,11,12,13, 14. la cosa importante, è anche un metodo popolare usato per salvare ematopoietici difetti in embrioni mutanti13,15.
Protocol
Representative Results
Discussion
È noto che HSCs maturo nel midollo osseo può ripopolare il sistema sangue di destinatari irradiati. A differenza di questi HSCs funzionale, le HSCs emergenti in AGM degli embrioni del mouse sono immaturi. Risultati di trapianto diretto ha mostrato quel tipo mi (VE-cad+ CD45– CD41+) e tipo II (VE-cad+ CD45+) pre-HSCs possedere nessuna capacità di ricostituzione20. Sfruttando il sistema di coltura explant AGM, il nascente HSCs nella regione…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Suwei Gao per aiuto nella preparazione di figura. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal National Foundation Natural Science of China (81530004, 31425016) e il Ministero della scienza e tecnologia della Cina (2016YFA0100500). J.L. eseguito gli esperimenti e redatto il manoscritto; F.L. modificato il manoscritto. Entrambi gli autori letto ed approvato il manoscritto finale.
Materials
| durapore 0.65 µm filters | Millipore | R5BA63787 | AGM explant culture |
| M5300 long-term culture medium | Stem Cell Technologies | 5300 | AGM explant culture |
| Trizol | Tiangen | 5829 | RNA extration |
| M-MLV reverse transcriptase | Promega | 90694 | reverse transcription |
| SYBR Green | Qiagen | A6002 | quantatitive real-time PCR |
| protease inhibitor | Roche | 55622 | Protein extration |
| collagenase | Sigma | C2674 | digestion of AGM tissues |
| MethoCult GF M3434 medium | Stem Cell Technologies | 3434 | CFU-C assay |
| ultra-low attachment 24-well plates | Costar | 3473 | CFU-C assay |
| C57BL/6 CD45.2 mice | Beijing HFK Bioscience Co. Ltd | CFU-S assay | |
| C57BL/6 CD45.1 mice | Beijing HFK Bioscience Co. Ltd | Long-term transplantation | |
| phosphate buffered saline | Life Technologines | 8115284 | AGM Collection |
| Penicillin-Streptomycin solution | HyClone | SV30010 | AGM explant culture |
| anti-CD45.2-PE-CY7 | eBioscience | 25-0454-80 | Long-term transplantation |
| anti-CD45-FITC | eBioscience | 11-0451-81 | Long-term transplantation |
| UV lamp | Beijing jiangmorning yuan bio-technology co., LTD | 039-14402 | power: 30W |
| stainless steel mesh | AS ONE SHANGHAI Corporation | 2-9817-10 | aperture diameter: 2.5 mm |
| hydrocortisone | Sigma | H0396 | selectively diluted into M5300 medium |
References
- Bertrand, J. Y., et al. Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development. Nature. 464, 108-111 (2010).
- Boisset, J. C., Robin, C. Imaging the founder of adult hematopoiesis in the mouse embryo aorta. Cell cycle. 9, 2489-2490 (2010).
- Kissa, K., Herbomel, P. Blood stem cells emerge from aortic endothelium by a novel type of cell transition. Nature. 464, 112-115 (2010).
- Zovein, A. C., et al. Fate tracing reveals the endothelial origin of hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 3, 625-636 (2008).
- Kumaravelu, P., et al. Quantitative developmental anatomy of definitive haematopoietic stem cells long-term repopulating units (HSC/RUs): role of the aorta-gonad-mesonephros (AGM) region and the yolk sac in colonisation of the mouse embryonic liver. Development. 129, 4891-4899 (2002).
- Orkin, S. H., Zon, L. I. Hematopoiesis: an evolving paradigm for stem cell biology. Cell. 132, 631-644 (2008).
- Medvinsky, A., Dzierzak, E. Definitive hematopoiesis is autonomously initiated by the AGM region. Cell. 86, 897-906 (1996).
- Peeters, M., et al. Ventral embryonic tissues and Hedgehog proteins induce early AGM hematopoietic stem cell development. Development. 136, 2613-2621 (2009).
- Taoudi, S., Medvinsky, A. Functional identification of the hematopoietic stem cell niche in the ventral domain of the embryonic dorsal aorta. PNAS. 104, 9399-9403 (2007).
- Crisan, M., et al. BMP and Hedgehog Regulate Distinct AGM Hematopoietic Stem Cells Ex Vivo. Stem Cell Reports. 6, 383-395 (2016).
- Durand, C., et al. Embryonic stromal clones reveal developmental regulators of definitive hematopoietic stem cells. PNAS. 104, 20838-20843 (2007).
- Fleury, M., Petit-Cocault, L., Clay, D., Souyri, M. Mpl receptor defect leads to earlier appearance of hematopoietic cells/hematopoietic stem cells in the Aorta-Gonad-Mesonephros region, with increased apoptosis. Int J Dev Biol. 54, 1067-1074 (2010).
- Lv, J., Wang, L., Gao, Y., Ding, Y. Q., Liu, F. 5-hydroxytryptamine synthesized in the aorta-gonad-mesonephros regulates hematopoietic stem and progenitor cell survival. J Exp Med. 214, 529-545 (2017).
- Souilhol, C., et al. Inductive interactions mediated by interplay of asymmetric signalling underlie development of adult haematopoietic stem cells. Nature communications. 7, 10784 (2016).
- Fitch, S. R., et al. Signaling from the sympathetic nervous system regulates hematopoietic stem cell emergence during embryogenesis. Cell Stem Cell. 11, 554-566 (2012).
- Bianchi, M., Moser, C., Lazzarini, C., Vecchiato, E., Crespi, F. Forced swimming test and fluoxetine treatment: in vivo evidence that peripheral 5-HT in rat platelet-rich plasma mirrors cerebral extracellular 5-HT levels, whilst 5-HT in isolated platelets mirrors neuronal 5-HT changes. Exp Brain Res. 143, 191-197 (2002).
- Ortiz, J., Artigas, F. Effects of monoamine uptake inhibitors on extracellular and platelet 5-hydroxytryptamine in rat blood: different effects of clomipramine and fluoxetine. Br J Pharmacol. 105, 941-946 (1992).
- Wong, D. T., Horng, J. S., Bymaster, F. P., Hauser, K. L., Molloy, B. B. A selective inhibitor of serotonin uptake: Lilly 110140, 3-(p-trifluoromethylphenoxy)-N-methyl-3-phenylpropylamine. Life sciences. 15, 471-479 (1974).
- Chen, M. J., Yokomizo, T., Zeigler, B. M., Dzierzak, E., Speck, N. A. Runx1 is required for the endothelial to haematopoietic cell transition but not thereafter. Nature. 457, 887-891 (2009).
- Rybtsov, S., et al. Hierarchical organization and early hematopoietic specification of the developing HSC lineage in the AGM region. J Exp Med. 208, 1305-1315 (2011).
- Muthuswamy, S. K. Bringing together the organoid field: from early beginnings to the road ahead. Development. 144, 963-967 (2017).
