Application du système de Culture aorte-gonades-mésonéphros Explant dans l’hématopoïèse perfectionnement
Summary
Ce protocole décrit l’utilisation d’aorte-gonades-celles cultivées pour les analyses d’expression, unités formant des colonies dans la culture et de la rate et la reconstitution à long terme pour déterminer l’effet des facteurs de régulation et les voies de signalisation sur souches hématopoïétiques développement des cellules. Cela a été démontré comme un système efficace pour l’étude de fonction et la biologie de cellules souches hématopoïétiques.
Abstract
La limitation de l’utilisation des embryons de souris pour les études de l’hématopoïèse est l’inconvénient supplémentaire dans les opérations, qui est en grande partie due au développement intra-utérin de l’embryon. Bien que les données génétiques de souris knockout (KO) sont convaincants, il n’est pas réaliste pour produire des souris KO pour tous les gènes selon les besoins. En outre, effectuer en vivo sauvetage expériences afin de consolider les données obtenues des souris KO n’est pas commode. Pour surmonter ces limites, la culture d’explants d’aorte-gonades-mésonéphros (AGM) a été développée comme un système approprié d’étudier le développement de cellules souches hématopoïétiques (CSH). Surtout pour des expériences de sauvetage, il peut être utilisé pour récupérer l’hématopoïèse altérée chez les souris KO. En ajoutant les produits chimiques appropriés dans le milieu, la signalisation ayant une déficience peut être réactivée ou voies de régulation peuvent être inhibées. Avec l’utilisation de cette méthode, beaucoup d’expériences peuvent être effectuées pour identifier les régulateurs critiques du développement HSC, y compris de HSC liées à l’expression des gènes à des niveaux d’ARNm et de protéines, la capacité de formation de colonie et capacité de reconstitution. Cette série d’expériences serait utile pour définir les mécanismes sous-jacents essentiels pour le développement de l’HSC chez les mammifères.
Introduction
Les cellules souches hématopoïétiques (CSH) sont spécifiques des tissus de cellules souches adultes qui possèdent des cellules lymphoïdes et multilignée potentiel y compris érythroïdes, myéloïde, ainsi que la capacité à se renouveler. Des études récentes ont montré que les premiers autorenouveler provient d’une population endothéliale spécialisée, appelée endothélium hemogenic (HE), à travers l’endothélium de transition hématopoïétique (ISE) à la paroi ventrale de l’aorte dorsale1,2 ,3,4. Une fois formé dans la région aorte-gonades-mésonéphros (AGA) d’embryonnaire (E) 10,5 à E12.5 dans l’embryon de souris, GPX va migrer dans le foie fœtal pour l’expansion et finalement coloniser la moelle osseuse afin de maintenir l’hématopoïèse adulte tout au long de la vie d’un individu 5 , 6. bien que cela ait été étudiée pendant de nombreuses années, les mécanismes sous-jacents des HSC émergence et le développement restent incomplètement compris.
Contrairement à la fécondation in vitro et le développement de l’embryon de poisson zèbre, développement intra-utérin d’embryons de souris rend l’étude de l’hématopoïèse définitive au cours de l’embryogenèse beaucoup plus gênant. Bien que des expériences génétiques à l’aide de la souris knockout (KO) sont couramment utilisés, l’absence de certaines souris KO limite aussi leur utilisation dans le domaine de la recherche hématopoïétique. En outre, des expériences in vivo sauvetage ne sont pas facilement effectuées chez la souris KO. Depuis 1996, la culture d’explants d’AGA a été développée pour études hématopoïétiques par les pionniers dans la zone7. Avec l’aide de ce système de culture, tissus ventrales de la région d’AGA ont été identifiés pour promouvoir l’activité de l’HSC, tandis que les tissus dorsales exercent un autre effet8,9. Le système de culture des explants AGM a également été appliqué pour déterminer le rôle de la sérotonine, Mpl, SCF, BMP et HSC développement10,11,12,13, de signalisation Hedgehog 14. ce qui est important, c’est aussi une méthode populaire utilisée pour sauver des défauts hématopoïétiques en embryons mutants13,15.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il est bien connu que CSH matures dans la moelle osseuse peut repeupler l’approvisionnement en sang des receveurs irradiés. Contrairement à ces autorenouveler fonctionnelle, le CSH émergentes dans l’Assemblée générale annuelle des embryons de souris est immatures. Transplantation directe est ressorti ce type j’ai (VE-cad+ CD45– CD41+) et type II (VE-cad+ CD45+) pre-CSH posséder aucune reconstitution capacité20. Profitant du sys…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Suwei Gao d’aide dans la préparation de la figure. Ce travail a été soutenu par des subventions de la Fondation nationale sciences naturelles de Chine (81530004, 31425016) et le ministère des sciences et technologie de la Chine (2016YFA0100500). J.L. effectué les expériences et rédigé le manuscrit ; F.L. édition le manuscrit. Les deux auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final.
Materials
| durapore 0.65 µm filters | Millipore | R5BA63787 | AGM explant culture |
| M5300 long-term culture medium | Stem Cell Technologies | 5300 | AGM explant culture |
| Trizol | Tiangen | 5829 | RNA extration |
| M-MLV reverse transcriptase | Promega | 90694 | reverse transcription |
| SYBR Green | Qiagen | A6002 | quantatitive real-time PCR |
| protease inhibitor | Roche | 55622 | Protein extration |
| collagenase | Sigma | C2674 | digestion of AGM tissues |
| MethoCult GF M3434 medium | Stem Cell Technologies | 3434 | CFU-C assay |
| ultra-low attachment 24-well plates | Costar | 3473 | CFU-C assay |
| C57BL/6 CD45.2 mice | Beijing HFK Bioscience Co. Ltd | CFU-S assay | |
| C57BL/6 CD45.1 mice | Beijing HFK Bioscience Co. Ltd | Long-term transplantation | |
| phosphate buffered saline | Life Technologines | 8115284 | AGM Collection |
| Penicillin-Streptomycin solution | HyClone | SV30010 | AGM explant culture |
| anti-CD45.2-PE-CY7 | eBioscience | 25-0454-80 | Long-term transplantation |
| anti-CD45-FITC | eBioscience | 11-0451-81 | Long-term transplantation |
| UV lamp | Beijing jiangmorning yuan bio-technology co., LTD | 039-14402 | power: 30W |
| stainless steel mesh | AS ONE SHANGHAI Corporation | 2-9817-10 | aperture diameter: 2.5 mm |
| hydrocortisone | Sigma | H0396 | selectively diluted into M5300 medium |
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