تطبيق نظام الثقافة Explant الشريان الاورطي-الغدد التناسلية-ميسونيفروس في هيماتوبويسيس الإنمائية
Summary
ويصف هذا البروتوكول استخدام مثقف الشريان الاورطي-الغدد التناسلية-ميسونيفروس لتعبير تحاليل، الوحدات المكونة للمستعمرة في الثقافة والطحال، وإعادة بناء طويلة الأجل لتحديد تأثير العوامل التنظيمية ومسارات الإشارات على الجذعية المكونة للدم خلية التنمية. وقد ثبت كنظام فعال لدراسة بيولوجيا الخلايا الجذعية المكونة للدم ووظيفة.
Abstract
الحد من استخدام الماوس الأجنة للدراسات هيماتوبويسيس من الإزعاج وأضاف في العمليات، وإلى حد كبير نتيجة لتطور الجنين داخل الرحم. على الرغم من أن تكون مقنعة البيانات الوراثية من الفئران خروج المغلوب (كو)، أنه من غير الواقعي لتوليد الفئران كو لجميع الجينات حسب الحاجة. وبالإضافة إلى ذلك، تؤدي في فيفو تجارب الإنقاذ لتوحيد البيانات المستقاة من الفئران كو ليست مريحة. للتغلب على هذه القيود، تم تطوير ثقافة explant الشريان الاورطي-الغدد التناسلية-ميسونيفروس (AGM) كنظام مناسب لدراسة تطوير الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSC). خاصة بالنسبة لتجارب الإنقاذ، يمكن استخدامه لاسترداد هيماتوبويسيس البصر في الفئران كو. بإضافة المواد الكيميائية المناسبة في المتوسط، مما يشير إلى ضعف يمكن إعادة تنشيط أو يمكن أن تعوق ينظم متابعة مسارات. باستخدام هذا الأسلوب، يمكن إجراء تحديد المنظمين الحرجة للتنمية HSC العديد من التجارب، بما في ذلك HSC المتصلة بالتعبير الجيني في مستويات البروتين ومرناً، والقدرة على تشكيل مستعمرة، وإعادة تشكيل القدرات. هذه السلسلة من التجارب ستكون مفيدة في تحديد الآليات الكامنة ضروري للتنمية HSC في الثدييات.
Introduction
الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs) هي خاصة بأنسجة الخلايا الجذعية البالغة التي تمتلك إمكانيات مولتيلينيجي بما في ذلك محمر، النقوي، والخلايا اللمفاوية، فضلا عن القدرة على تجديد نفسها. وقد أظهرت الدراسات الأخيرة أن هسكس أقرب نشأت من سكان غشائي متخصصة، المعروفة باسم البطانة هيموجينيك (أنه)، عن طريق بطانية للانتقال المكونة للدم (ات) في الجدار البطني الاورطي الظهرية1،2 ،،من34. حالما تتشكل في الشريان الاورطي-الغدد التناسلية-ميسونيفروس المنطقة (AGM) الجنينية (ﻫ) 10.5 من إلى E12.5 في الجنين الماوس، هسكس سوف تهاجر إلى كبد الجنين للتوسع واستعمار وأخيراً نخاع العظام للحفاظ على هيماتوبويسيس الكبار طوال حياة الفرد 5 , 6-على الرغم من أن هذا قد درست لسنوات عديدة، الآليات الكامنة وراء ظهور HSC والتنمية ما زالت مفهومة.
خلافا للاخصاب في الأنابيب وتطوير الأجنة الزرد، التنمية داخل الرحم للأجنة الماوس يجعل دراسة هيماتوبويسيس نهائي خلال embryogenesis غير مريح أكثر بكثير. على الرغم من أن التجارب الجينية باستخدام الفئران خروج المغلوب (كو) تستخدم عادة، عدم وجود بعض الفئران كو كما يحد من استخدامها في مجال الأبحاث المكونة للدم. وبالإضافة إلى ذلك، لا يقوم في فيفو تجارب الإنقاذ بسهولة في الفئران كو. منذ عام 1996، وضعت ثقافة explant الجمعية العمومية للدراسات المكونة للدم من الرواد في حقل7. مع المساعدة من هذا النظام الثقافي، تم تحديد الأنسجة البطني لمنطقة الجمعية العمومية لتشجيع النشاط HSC، بينما الأنسجة الظهرية ممارسة معاكس8،تأثير9. كما تم تطبيق نظام الثقافة explant AGM لتحديد دور كل من السيروتونين والمكتبة، وصندوق إنقاذ الطفولة، BMP والقنفذ إشارات في HSC التنمية10،11،،من1213، 14-الأهم من ذلك، وأيضا طريقة شعبية تستخدم لإنقاذ العيوب المكونة للدم في الأجنة متحولة13،15.
Protocol
Representative Results
Discussion
فمن المعروف جيدا أن هسكس الناضجة في نخاع العظام يمكن إعادة ملء نظام الدم المستلمين المشع. على عكس هذه هسكس الفنية، هسكس الناشئة في الجمعية العمومية للأجنة الماوس غير ناضجة. أظهرت نتائج الزرع المباشر هذا النوع أنا (VE-كندي+ CD45– CD41+) والنوع الثاني (VE-كندي+ CD45+) هسكس…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نشكر قاو صاوي للحصول على مساعدة في إعداد الشكل. وأيد هذا العمل المنح المقدمة من الوطنية العلوم الطبيعية مؤسسة في الصين (81530004, 31425016) ووزارة العلوم والتكنولوجيا في الصين (2016YFA0100500). ج. ل. إجراء التجارب وصياغة هذه المخطوطة؛ تحرير المخطوطة. قراءة كلا المؤلفين ووافق المخطوط النهائي.
Materials
| durapore 0.65 µm filters | Millipore | R5BA63787 | AGM explant culture |
| M5300 long-term culture medium | Stem Cell Technologies | 5300 | AGM explant culture |
| Trizol | Tiangen | 5829 | RNA extration |
| M-MLV reverse transcriptase | Promega | 90694 | reverse transcription |
| SYBR Green | Qiagen | A6002 | quantatitive real-time PCR |
| protease inhibitor | Roche | 55622 | Protein extration |
| collagenase | Sigma | C2674 | digestion of AGM tissues |
| MethoCult GF M3434 medium | Stem Cell Technologies | 3434 | CFU-C assay |
| ultra-low attachment 24-well plates | Costar | 3473 | CFU-C assay |
| C57BL/6 CD45.2 mice | Beijing HFK Bioscience Co. Ltd | CFU-S assay | |
| C57BL/6 CD45.1 mice | Beijing HFK Bioscience Co. Ltd | Long-term transplantation | |
| phosphate buffered saline | Life Technologines | 8115284 | AGM Collection |
| Penicillin-Streptomycin solution | HyClone | SV30010 | AGM explant culture |
| anti-CD45.2-PE-CY7 | eBioscience | 25-0454-80 | Long-term transplantation |
| anti-CD45-FITC | eBioscience | 11-0451-81 | Long-term transplantation |
| UV lamp | Beijing jiangmorning yuan bio-technology co., LTD | 039-14402 | power: 30W |
| stainless steel mesh | AS ONE SHANGHAI Corporation | 2-9817-10 | aperture diameter: 2.5 mm |
| hydrocortisone | Sigma | H0396 | selectively diluted into M5300 medium |
References
- Bertrand, J. Y., et al. Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development. Nature. 464, 108-111 (2010).
- Boisset, J. C., Robin, C. Imaging the founder of adult hematopoiesis in the mouse embryo aorta. Cell cycle. 9, 2489-2490 (2010).
- Kissa, K., Herbomel, P. Blood stem cells emerge from aortic endothelium by a novel type of cell transition. Nature. 464, 112-115 (2010).
- Zovein, A. C., et al. Fate tracing reveals the endothelial origin of hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 3, 625-636 (2008).
- Kumaravelu, P., et al. Quantitative developmental anatomy of definitive haematopoietic stem cells long-term repopulating units (HSC/RUs): role of the aorta-gonad-mesonephros (AGM) region and the yolk sac in colonisation of the mouse embryonic liver. Development. 129, 4891-4899 (2002).
- Orkin, S. H., Zon, L. I. Hematopoiesis: an evolving paradigm for stem cell biology. Cell. 132, 631-644 (2008).
- Medvinsky, A., Dzierzak, E. Definitive hematopoiesis is autonomously initiated by the AGM region. Cell. 86, 897-906 (1996).
- Peeters, M., et al. Ventral embryonic tissues and Hedgehog proteins induce early AGM hematopoietic stem cell development. Development. 136, 2613-2621 (2009).
- Taoudi, S., Medvinsky, A. Functional identification of the hematopoietic stem cell niche in the ventral domain of the embryonic dorsal aorta. PNAS. 104, 9399-9403 (2007).
- Crisan, M., et al. BMP and Hedgehog Regulate Distinct AGM Hematopoietic Stem Cells Ex Vivo. Stem Cell Reports. 6, 383-395 (2016).
- Durand, C., et al. Embryonic stromal clones reveal developmental regulators of definitive hematopoietic stem cells. PNAS. 104, 20838-20843 (2007).
- Fleury, M., Petit-Cocault, L., Clay, D., Souyri, M. Mpl receptor defect leads to earlier appearance of hematopoietic cells/hematopoietic stem cells in the Aorta-Gonad-Mesonephros region, with increased apoptosis. Int J Dev Biol. 54, 1067-1074 (2010).
- Lv, J., Wang, L., Gao, Y., Ding, Y. Q., Liu, F. 5-hydroxytryptamine synthesized in the aorta-gonad-mesonephros regulates hematopoietic stem and progenitor cell survival. J Exp Med. 214, 529-545 (2017).
- Souilhol, C., et al. Inductive interactions mediated by interplay of asymmetric signalling underlie development of adult haematopoietic stem cells. Nature communications. 7, 10784 (2016).
- Fitch, S. R., et al. Signaling from the sympathetic nervous system regulates hematopoietic stem cell emergence during embryogenesis. Cell Stem Cell. 11, 554-566 (2012).
- Bianchi, M., Moser, C., Lazzarini, C., Vecchiato, E., Crespi, F. Forced swimming test and fluoxetine treatment: in vivo evidence that peripheral 5-HT in rat platelet-rich plasma mirrors cerebral extracellular 5-HT levels, whilst 5-HT in isolated platelets mirrors neuronal 5-HT changes. Exp Brain Res. 143, 191-197 (2002).
- Ortiz, J., Artigas, F. Effects of monoamine uptake inhibitors on extracellular and platelet 5-hydroxytryptamine in rat blood: different effects of clomipramine and fluoxetine. Br J Pharmacol. 105, 941-946 (1992).
- Wong, D. T., Horng, J. S., Bymaster, F. P., Hauser, K. L., Molloy, B. B. A selective inhibitor of serotonin uptake: Lilly 110140, 3-(p-trifluoromethylphenoxy)-N-methyl-3-phenylpropylamine. Life sciences. 15, 471-479 (1974).
- Chen, M. J., Yokomizo, T., Zeigler, B. M., Dzierzak, E., Speck, N. A. Runx1 is required for the endothelial to haematopoietic cell transition but not thereafter. Nature. 457, 887-891 (2009).
- Rybtsov, S., et al. Hierarchical organization and early hematopoietic specification of the developing HSC lineage in the AGM region. J Exp Med. 208, 1305-1315 (2011).
- Muthuswamy, S. K. Bringing together the organoid field: from early beginnings to the road ahead. Development. 144, 963-967 (2017).
