Summary

Anwendung der Aorta-Gonade-Wachstum Explant Kultursystem in Developmental Hämatopoese

Published: November 03, 2017
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Summary

Dieses Protokoll beschreibt mit kultivierten Aorta-Gonade-Wachstum für Expressionsanalysen, Koloniebildenden Einheiten in die Kultur und die Milz und die langfristige Wiederherstellung um zu bestimmen, die Auswirkungen der regulatorischen Faktoren und Signalwege auf hämatopoetischen Stammzellen Zellentwicklung. Dies wurde als ein wirksames System zur Untersuchung von hämatopoetischen Stammzellen-Biologie und Funktion nachgewiesen.

Abstract

Die Einschränkung bei der Verwendung von Mäuseembryonen für Blutbildung Studien ist die zusätzliche Unannehmlichkeiten bei Operationen, weitgehend aufgrund der intrauterinen Entwicklung des Embryos. Obwohl genetische Daten von Knockout (KO)-Mäusen überzeugend sind, ist es nicht realistisch, KO Mäuse für alle Gene zu erzeugen, wie gebraucht. Darüber hinaus durchführen in Vivo Rettung Experimente zur Konsolidierung der Daten erhalten von KO-Mäusen ist nicht bequem. Um diese Einschränkungen zu überwinden, entwickelte sich die Aorta-Gonade-Wachstum (AGM) Explant Kultur als ein geeignetes System, hämatopoetischen Stammzellen (HSC) Entwicklung zu studieren. Vor allem für Rettung Experimente es lässt sich die beeinträchtigte Blutbildung in KO-Mäusen zu erholen. Durch das Hinzufügen der entsprechenden Chemikalien in das Medium, die beeinträchtigt Signalisierung kann reaktiviert werden oder Up-regulierten Bahnen gehemmt werden können. Mit dem Einsatz dieser Methode viele Experimente können durchgeführt werden, um die kritischen Regulatoren der HSC Entwicklung identifizieren, einschließlich HSC im Zusammenhang mit gen-Expression auf mRNA und Protein Ebenen, Kolonie Bildung Fähigkeit und Rekonstitution Kapazität. Diese Serie von Experimenten wäre hilfreich bei der Festlegung der zugrunde liegenden Mechanismen für HSC-Entwicklung bei Säugetieren.

Introduction

Hämatopoetischen Stammzellen (HSCs) sind gewebespezifischen adulten Stammzellen, der besitzen multilineage Potenzial einschließlich erythroiden, myeloische, und lymphatischen Zellen, sowie die Fähigkeit, selbst zu erneuern. Jüngste Studien haben gezeigt, dass die frühesten HSCs aus einer spezialisierten Endothelzellen Bevölkerung entstand, bekannt als Hemogenic Endothel (HE), durch die endotheliale hämatopoetischen Übergang (EHT) an der ventralen Wand des dorsalen Aorta1,2 ,3,4. Sobald die Aorta-Gonade-Wachstum (AGM) Region von embryonalen (E) 10,5 bis E12.5 in der Maus-Embryo gebildet, HSCs Wandern in der fetalen Leber für die Erweiterung und schließlich besiedeln das Knochenmark zu adulten Hämatopoese im gesamten Leben eines Individuums zu pflegen 5 , 6. obwohl dies seit vielen Jahren erforscht wird, die zugrunde liegenden Mechanismen der HSC-Entstehung und Entwicklung bleiben unvollständig verstanden.

Im Gegensatz zu in-vitro- Befruchtung und Entwicklung des Zebrafisch-Embryonen macht intrauterinen Entwicklung von Mäuseembryonen das Studium der definitiven Hämatopoese in der Embryogenese viel unbequemer. Obwohl genetische Experimente mit Knockout (KO)-Mäusen allgemein verwendet sind, schränkt das Fehlen von bestimmten KO-Mäusen auch ihre Verwendung im Bereich hämatopoetischen Forschung. Darüber hinaus werden in Vivo Rettung Versuche nicht leicht in KO-Mäusen durchgeführt. Seit 1996 wurde die AGM Explant Kultur für hämatopoetische Studien von den Pionieren im Bereich7entwickelt. Mit Hilfe dieses Kultur-Systems identifizierten ventralen Gewebe der AGM-Region HSC Aktivität zu fördern, während dorsalen Gewebe eine entgegengesetzte Wirkung8,9ausüben. Die AGM Explant Kultursystem wurde auch angewendet, um festzustellen, die Rolle von Serotonin, Mpl, SCF, BMP und Igel Signalisierung in HSC Entwicklung10,11,12,13, 14. wichtiger ist, es ist auch eine beliebte Methode, hämatopoetischen Mängel in der mutierten Embryonen13,15zu retten.

Protocol

alle Verfahren, die unter anderem tierische Themen von der ethischen Review Committee im Institut für Zoologie, chinesische Akademie der Wissenschaften, Peking, China genehmigt worden. 1. Material Vorbereitung Sterilisation der 0,65 µm Filter mit UV Strahlen produziert unter dem ultravioletten Strahl der Lampe auf die sauberen Werkbank für 4 h und die Filter nach 2 h-Kennzeichen umdrehen. Hinweis: Wenn Sie mit UV-Licht arbeiten, entsprechende Verschleißschutz. …

Representative Results

Eine kürzlich erschienenen Publikation berichtet, endothelial Zelle abgeleitet Serotonin das Überleben der HSCs fördert durch die Hemmung des Pro-apoptotische Weges in der AGM-13. Um die Förderung Wirkung von Serotonin auf HSC Entwicklung bestätigen, war Fluoxetin enthalten. Als eine selektive Serotonin-Wiederaufnahmehemmer (SSRI) nachweislich die Fluoxetin hemmen Serotonin-Re-Absorption in peripheren Geweben16,<sup class="xr…

Discussion

Es ist bekannt, dass Reife HSCs im Knochenmark können das Blutsystem der bestrahlten Empfänger neu zu besiedeln. Im Gegensatz zu diesen funktionalen HSCs sind die aufstrebenden HSCs an der Hauptversammlung von Mäuseembryonen unreif. Direkte Transplantation Ergebnisse zeigten, dass Typ ich (VE-CAD-+ CD45 CD41+) und Typ II (VE-CAD-+ CD45+) Pre-HSCs besitzen keine Rekonstitution Fähigkeit20. Unter Ausnutzung der AGM Explant Kultursystem, d…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Suwei Gao für Hilfe bei der Vorbereitung der Figur. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse aus dem National Natural Science Foundation of China (81530004, 31425016) und das Ministerium für Wissenschaft und Technology of China (2016YFA0100500). J.l. die Experimente durchgeführt und das Manuskript verfasst; F.l. bearbeitet das Manuskript. Beide Autoren gelesen und genehmigt das endgültige Manuskript.

Materials

durapore 0.65 µm filters Millipore R5BA63787 AGM explant culture
M5300 long-term culture medium Stem Cell Technologies 5300 AGM explant culture
Trizol  Tiangen 5829 RNA extration
M-MLV reverse transcriptase Promega 90694 reverse transcription
SYBR Green Qiagen A6002 quantatitive real-time PCR
protease inhibitor Roche 55622 Protein extration
collagenase Sigma C2674 digestion of AGM tissues
MethoCult GF M3434 medium Stem Cell Technologies 3434 CFU-C assay
ultra-low attachment 24-well plates Costar 3473 CFU-C assay
C57BL/6 CD45.2 mice Beijing HFK Bioscience Co. Ltd CFU-S assay
C57BL/6 CD45.1 mice Beijing HFK Bioscience Co. Ltd Long-term transplantation
phosphate buffered saline Life Technologines 8115284 AGM Collection
Penicillin-Streptomycin solution HyClone SV30010 AGM explant culture
anti-CD45.2-PE-CY7 eBioscience 25-0454-80 Long-term transplantation
anti-CD45-FITC eBioscience 11-0451-81 Long-term transplantation
UV lamp Beijing jiangmorning yuan bio-technology co., LTD 039-14402 power: 30W
stainless steel mesh AS ONE SHANGHAI Corporation 2-9817-10  aperture diameter: 2.5 mm
hydrocortisone Sigma H0396 selectively diluted into M5300 medium

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Cite This Article
Lv, J., Liu, F. Application of Aorta-gonad-mesonephros Explant Culture System in Developmental Hematopoiesis. J. Vis. Exp. (129), e56557, doi:10.3791/56557 (2017).

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