造血の発達における大動脈生殖巣中植文化システムのアプリケーション
Summary
このプロトコルを記述する発現解析、文化と脾臓、および長期的な再構成のコロニー形成単位の培養大動脈生殖巣中腎を使用して造血幹に及ぼす制御因子、シグナル伝達経路を決定するには細胞の開発。これは、造血幹細胞生物学、機能を研究するための効果的なシステムとして実証されています。
Abstract
マウス胚を用いた造血研究の制限は、主に胚の子宮内開発のための操作で追加の不便です。ノックアウト (KO) マウスの遺伝データが説得力のある、すべて遺伝子 KO マウスを必要に応じて生成するは現実的ではありません。さらに、生体内で実行する KO マウスから得られたデータを統合するレスキュー実験不便です。これらの制限を克服するために、大動脈性腺発生 (AGM) 培養は、造血幹細胞 (HSC) の開発を検討する適切なシステムとして開発されました。特にレスキュー実験の KO マウスの造血の障害を回復に使えます。適切な化学物質をメディアに追加すると、障害信号を再開することができます。 または調整された細道を禁じることができます。このメソッドの使用は、多くの実験は HSC の開発の重要な調整装置を識別するために実行することができます、HSC など関連する遺伝子の発現 mRNA および蛋白質レベル、コロニー形成能力および再構成能力。この一連の実験は哺乳類における HSC 開発に欠かせない根本的なメカニズムを定義するのに役立つでしょう。
Introduction
造血幹細胞 (造血)、組織固有成体幹細胞多能性赤芽球、骨髄性を含むリンパ球様細胞と自己更新する能力を持っています。最近の研究は、初期の HSCs が背側大動脈1,2 の腹側の壁で造血転移 (EHT) 血管内皮を介して hemogenic 内皮 (彼) と呼ばれる特殊な血管内皮人口に生じた示されています。 ,3,4。マウス胚における E12.5 に胚 (E) 10.5 から大動脈生殖巣中の (AGM) 地域に結成され、一度 HSCs が拡張のため胎児の肝臓に移行、最終的に個人の生活の中で成人の造血を維持するために骨髄を植民地化5,6。 これは、長年にわたって研究されている、HSC の出現と発展の基になるメカニズムの不完全な理解まま。
体外受精やゼブラフィッシュ胚の開発と違ってマウス胚の子宮内開発研究を行う決定的な造血の胚形成の間にはるかに不便。ノックアウト (KO) マウスを用いた遺伝子実験が一般に利用が特定の KO マウスの不足はまた造血研究分野での使用を制限します。さらに、レスキューを実験する生体内では、KO マウスで簡単には実行されません。1996 年以来、AGM 培養は、フィールド7の開拓者によって造血研究開発されています。この文化システムの助けを借りて、AGM 部腹側の組織は、背側の組織は、反対の効果8,9を発揮しながら、HSC の活動を促進するために識別されています。AGM 植文化システムは、セロトニン、Mpl、SCF、BMP、および HSC 開発10、11,12,13,におけるヘッジホッグのロールを判断に適用されています。14します。 重要なことは、また変異胚13,15造血欠陥を救助するために使用人気のある方法です。
Protocol
Representative Results
Discussion
骨髄で成熟した造血が照射受信者の血システムを再作成することができますが知られています。異なり、これらの機能の HSCs マウス胚の AGM で新興の HSCs は熟女ではありません。直接移植結果このような私 (VE cad+ CD45– CD41+) と II 型 (VE cad+ CD45+) 前 HSCs が再構成能力20を所有していません。AGM 植文化システム、AGM 地域における初期の HSC…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Suwei Gao は、図の準備のヘルプを感謝いたします。この作品は、国家自然科学基金、中国の (81530004、31425016) および科学省と中国の技術 (2016YFA0100500) からの助成金によって支えられました。J. l. が、実験を行い; 原稿を起草F. l. は、原稿を編集します。著者は両方とも読み、最終原稿を承認します。
Materials
| durapore 0.65 µm filters | Millipore | R5BA63787 | AGM explant culture |
| M5300 long-term culture medium | Stem Cell Technologies | 5300 | AGM explant culture |
| Trizol | Tiangen | 5829 | RNA extration |
| M-MLV reverse transcriptase | Promega | 90694 | reverse transcription |
| SYBR Green | Qiagen | A6002 | quantatitive real-time PCR |
| protease inhibitor | Roche | 55622 | Protein extration |
| collagenase | Sigma | C2674 | digestion of AGM tissues |
| MethoCult GF M3434 medium | Stem Cell Technologies | 3434 | CFU-C assay |
| ultra-low attachment 24-well plates | Costar | 3473 | CFU-C assay |
| C57BL/6 CD45.2 mice | Beijing HFK Bioscience Co. Ltd | CFU-S assay | |
| C57BL/6 CD45.1 mice | Beijing HFK Bioscience Co. Ltd | Long-term transplantation | |
| phosphate buffered saline | Life Technologines | 8115284 | AGM Collection |
| Penicillin-Streptomycin solution | HyClone | SV30010 | AGM explant culture |
| anti-CD45.2-PE-CY7 | eBioscience | 25-0454-80 | Long-term transplantation |
| anti-CD45-FITC | eBioscience | 11-0451-81 | Long-term transplantation |
| UV lamp | Beijing jiangmorning yuan bio-technology co., LTD | 039-14402 | power: 30W |
| stainless steel mesh | AS ONE SHANGHAI Corporation | 2-9817-10 | aperture diameter: 2.5 mm |
| hydrocortisone | Sigma | H0396 | selectively diluted into M5300 medium |
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