היישום של מערכת העורקים-בלוטת המין-mesonephros Explant התרבות Hematopoiesis התפתחותית
Summary
פרוטוקול זה מתאר שימוש בתרבית העורקים-בלוטת המין-Mesonephros עבור הביטוי ניתוחים, יחידות המושבה יוצרי תרבות, הטחול ולאחר שיחזור לטווח ארוך כדי לקבוע את ההשפעה של גורמים רגולטוריים, איתות המסלולים על גזע hematopoietic תא פיתוח. זה הוכח כמו מערכת יעילה ללמוד ביולוגיה של התא גזע hematopoietic ותפקוד.
Abstract
המגבלה של שימוש בעכבר העוברים ללימודי hematopoiesis היא הנוחיות הנוספת במבצעים, אשר נובע במידה רבה התפתחות העובר תוך רחמי. למרות משכנעים מידע גנטי של עכברים knockout (KO), זה לא מציאותי ליצירת עכברים KO עבור כל הגנים כנדרש. בנוסף, ביצוע ויוו הצלה ניסויים כדי לאחד את הנתונים המתקבלים KO עכברים אינה נוחה. כדי להתגבר על מגבלות אלה, התרבות explant של אבי העורקים-בלוטת המין-Mesonephros (AGM) פותחה כמערכת המתאימה ללמוד פיתוח תאי גזע hematopoietic (HSC). במיוחד לניסויים הצלה, זה יכול לשמש כדי לשחזר את hematopoiesis לקוי בעכברים KO. על ידי הוספת כימיקלים המתאימים לתוך האמצעי, האיתות לקוי ניתן להפעיל מחדש או מסלולים מוסדר למעלה ניתן והשרירי אותו. עם השימוש בשיטה זו, ניסויים רבים שניתן לבצע כדי לזהות הרגולטורים קריטיים של התפתחות מועדון הכדורגל מונפלייה, כולל מועדון הכדורגל מונפלייה הקשורים גנים ב mRNA ורמות החלבון, המושבה היווצרות יכולת והקיבולת הכינון. זו סדרה של ניסויים יהיה מועיל בהגדרת המנגנונים המשמשת כבסיס חיוני לפיתוח HSC ביונקים.
Introduction
תאי גזע hematopoietic (HSCs) הם תאי גזע בוגרים רקמות ספציפיות כי בעלי פוטנציאל multilineage כולל erythroid, מיאלואידית, ו הלימפה התאים, כמו גם לחדש את עצמי. מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי HSCs המוקדם התעוררו מתוך אוכלוסיה אנדותל מיוחדים, המכונה אנדותל hemogenic (HE), דרך אנדותל המעבר hematopoietic (בובה) בכותל הגחון של אבי העורקים הגבי1,2 3, ,4. לאחר שהוקמה באזור אבי העורקים-בלוטת המין-mesonephros (AGM) מעובריים (E) 10.5 כדי E12.5 העובר העכבר, HSCs נודדים אל הכבד העוברי של הרחבה, בסופו של דבר ליישב את מח העצם כדי לשמור על hematopoiesis למבוגרים לאורך החיים של הפרט 5 , 6. למרות זה נחקר במשך שנים רבות, המנגנון הבסיסי של מועדון הכדורגל מונפלייה הופעתה ופיתוח נשארים שהיישום מובן.
בניגוד הפריה במבחנה ופיתוח של דג זברה עוברי, פיתוח תוך רחמי העוברים העכבר הופך המחקר של hematopoiesis מוחלטת בזמן מופרה הרבה יותר נוח. למרות ניסויים גנטיים באמצעות הסתרה (KO) עכברים שאינם מנוצלים בדרך כלל, חוסר של עכברים KO מסוימים מגביל גם את השימוש בשטח המחקר hematopoietic. בנוסף, אין ויוו הצלה ניסויים לא בקלות מבוצעות בעכברים KO. מאז 1996, התרבות explant AGM פותחה ללימודי hematopoietic על ידי חלוצי בתעשיית השדה7. בעזרת מערכת זו תרבות, רקמות הגחון של האזור AGM זוהו לקדם פעילות מועדון הכדורגל מונפלייה, ואילו רקמות הגבי מפעילים של8,מול אפקט9. מערכת התרבות explant AGM הוחל גם כדי לקבוע את התפקידים של סרוטונין, הרישיון הציבורי של מוזילה, SCF, BMP וקיפוד איתות HSC פיתוח10,11,12,13, 14. חשוב, זה גם שיטה פופולארית נהגה להציל פגמים hematopoietic עוברי מוטציה13,15.
Protocol
Representative Results
Discussion
זה ידוע כי HSCs בוגרת במח העצם לשקם מערכת הדם של נמענים לקרינה. בניגוד HSCs פונקציונליים אלה, HSCs המתעוררים ב ומזכיר האסיפה של העכבר העוברים הן ילדותי. השתלת ישירה התוצאות הראו סוג זה אני (VE-cad+ CD45– CD41+) לבין סוג II (VE-cad+ CD45+) טרום-HSCs בעלי אין יכולת שיחזור20. נ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים Suwei גאו לעזרה בהכנה איור. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים של הלאומי מדעי הטבע קרן של סין (81530004, 31425016) ואת משרד המדע הטכנולוגיה של סין (2016YFA0100500). J.L. לבצע את הניסויים, ניסח את כתב היד; F.L. לערוך את כתב היד. שני מחברים לקרוא ואושר היצירה הסופית.
Materials
| durapore 0.65 µm filters | Millipore | R5BA63787 | AGM explant culture |
| M5300 long-term culture medium | Stem Cell Technologies | 5300 | AGM explant culture |
| Trizol | Tiangen | 5829 | RNA extration |
| M-MLV reverse transcriptase | Promega | 90694 | reverse transcription |
| SYBR Green | Qiagen | A6002 | quantatitive real-time PCR |
| protease inhibitor | Roche | 55622 | Protein extration |
| collagenase | Sigma | C2674 | digestion of AGM tissues |
| MethoCult GF M3434 medium | Stem Cell Technologies | 3434 | CFU-C assay |
| ultra-low attachment 24-well plates | Costar | 3473 | CFU-C assay |
| C57BL/6 CD45.2 mice | Beijing HFK Bioscience Co. Ltd | CFU-S assay | |
| C57BL/6 CD45.1 mice | Beijing HFK Bioscience Co. Ltd | Long-term transplantation | |
| phosphate buffered saline | Life Technologines | 8115284 | AGM Collection |
| Penicillin-Streptomycin solution | HyClone | SV30010 | AGM explant culture |
| anti-CD45.2-PE-CY7 | eBioscience | 25-0454-80 | Long-term transplantation |
| anti-CD45-FITC | eBioscience | 11-0451-81 | Long-term transplantation |
| UV lamp | Beijing jiangmorning yuan bio-technology co., LTD | 039-14402 | power: 30W |
| stainless steel mesh | AS ONE SHANGHAI Corporation | 2-9817-10 | aperture diameter: 2.5 mm |
| hydrocortisone | Sigma | H0396 | selectively diluted into M5300 medium |
References
- Bertrand, J. Y., et al. Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development. Nature. 464, 108-111 (2010).
- Boisset, J. C., Robin, C. Imaging the founder of adult hematopoiesis in the mouse embryo aorta. Cell cycle. 9, 2489-2490 (2010).
- Kissa, K., Herbomel, P. Blood stem cells emerge from aortic endothelium by a novel type of cell transition. Nature. 464, 112-115 (2010).
- Zovein, A. C., et al. Fate tracing reveals the endothelial origin of hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 3, 625-636 (2008).
- Kumaravelu, P., et al. Quantitative developmental anatomy of definitive haematopoietic stem cells long-term repopulating units (HSC/RUs): role of the aorta-gonad-mesonephros (AGM) region and the yolk sac in colonisation of the mouse embryonic liver. Development. 129, 4891-4899 (2002).
- Orkin, S. H., Zon, L. I. Hematopoiesis: an evolving paradigm for stem cell biology. Cell. 132, 631-644 (2008).
- Medvinsky, A., Dzierzak, E. Definitive hematopoiesis is autonomously initiated by the AGM region. Cell. 86, 897-906 (1996).
- Peeters, M., et al. Ventral embryonic tissues and Hedgehog proteins induce early AGM hematopoietic stem cell development. Development. 136, 2613-2621 (2009).
- Taoudi, S., Medvinsky, A. Functional identification of the hematopoietic stem cell niche in the ventral domain of the embryonic dorsal aorta. PNAS. 104, 9399-9403 (2007).
- Crisan, M., et al. BMP and Hedgehog Regulate Distinct AGM Hematopoietic Stem Cells Ex Vivo. Stem Cell Reports. 6, 383-395 (2016).
- Durand, C., et al. Embryonic stromal clones reveal developmental regulators of definitive hematopoietic stem cells. PNAS. 104, 20838-20843 (2007).
- Fleury, M., Petit-Cocault, L., Clay, D., Souyri, M. Mpl receptor defect leads to earlier appearance of hematopoietic cells/hematopoietic stem cells in the Aorta-Gonad-Mesonephros region, with increased apoptosis. Int J Dev Biol. 54, 1067-1074 (2010).
- Lv, J., Wang, L., Gao, Y., Ding, Y. Q., Liu, F. 5-hydroxytryptamine synthesized in the aorta-gonad-mesonephros regulates hematopoietic stem and progenitor cell survival. J Exp Med. 214, 529-545 (2017).
- Souilhol, C., et al. Inductive interactions mediated by interplay of asymmetric signalling underlie development of adult haematopoietic stem cells. Nature communications. 7, 10784 (2016).
- Fitch, S. R., et al. Signaling from the sympathetic nervous system regulates hematopoietic stem cell emergence during embryogenesis. Cell Stem Cell. 11, 554-566 (2012).
- Bianchi, M., Moser, C., Lazzarini, C., Vecchiato, E., Crespi, F. Forced swimming test and fluoxetine treatment: in vivo evidence that peripheral 5-HT in rat platelet-rich plasma mirrors cerebral extracellular 5-HT levels, whilst 5-HT in isolated platelets mirrors neuronal 5-HT changes. Exp Brain Res. 143, 191-197 (2002).
- Ortiz, J., Artigas, F. Effects of monoamine uptake inhibitors on extracellular and platelet 5-hydroxytryptamine in rat blood: different effects of clomipramine and fluoxetine. Br J Pharmacol. 105, 941-946 (1992).
- Wong, D. T., Horng, J. S., Bymaster, F. P., Hauser, K. L., Molloy, B. B. A selective inhibitor of serotonin uptake: Lilly 110140, 3-(p-trifluoromethylphenoxy)-N-methyl-3-phenylpropylamine. Life sciences. 15, 471-479 (1974).
- Chen, M. J., Yokomizo, T., Zeigler, B. M., Dzierzak, E., Speck, N. A. Runx1 is required for the endothelial to haematopoietic cell transition but not thereafter. Nature. 457, 887-891 (2009).
- Rybtsov, S., et al. Hierarchical organization and early hematopoietic specification of the developing HSC lineage in the AGM region. J Exp Med. 208, 1305-1315 (2011).
- Muthuswamy, S. K. Bringing together the organoid field: from early beginnings to the road ahead. Development. 144, 963-967 (2017).
