Изоляция Salmonella typhimurium-содержащих Phagosomes от макрофагов

Макрофаги являются циркулирующие специализированных фагоцитирующих клеток, которые обнаружить, поглотит и ухудшить любые иностранные частиц, присутствующих в периферических тканях, начиная от apoptotic клеток до вторжения микроорганизмов, таких как бактерии. После поверхности рецептор опосредованный признания возбудителя определенных маркеров обычно присутствует на поверхности микроорганизмов (известный как патоген связанные молекулярные структуры или PAMPs) макрофаги инициировать сложный реорганизации клеточной мембраны в для того, чтобы окружить и фагоцитируют возбудителя¹.

Охватившего патогена, затем содержится макрофагов в внутриклеточного везикул, известный как фагосомы. Через серию слияние и деление события с другими везикулы, таких как endosomes и лизосом возбудитель содержащих фагосомы приобретает набор белков, необходимых для ликвидации phagosomal содержание. Таким образом в ходе этого процесса, известный как фагосомы созревания²состав ферментативных фагосомы крайне непостоянны.

Вскоре после фагоцитоза, multimeric, которую комплекс вакуолярной АТФаза (v АТФаза) включена в мембране фагосомы сплавливанием с endosomes³. Этот комплекс использует АТФ для перекачки протонов от цитозоль для люмен фагосомы⁴. Подкисление фагосомы имеет важное значение для события слияния с другими везикулы⁵ и для активации большое количество рН зависимых ферментов и деструктивные⁶. Другой multimeric энзимный комплекс, который быстро собрал на мембране фагосомы представляет собой комплекс NADPH-оксидазы (NOX). NOX комплекс окисляет NADPH произвести реактивнооксигенных видов (ров), выделяется в просвете фагосомы и что существенный вклад в убийстве охватившего микроорганизмов⁷.

На первоначальных этапах созревания phagosomes настоящее время маркеры обычно как Rab5 и Rab7 раннего и позднего endosomes соответственно наряду с Субблок₀ V v АТФазы⁸. Слияние phagosomes с лизосом и позднего endosomes приводит к подверженности самые разнообразные гидролитические ферменты, такие как катепсин протеаз, липазы и β-галактозидазы⁹фагоцитированных возбудителя. Подкисление просвета также необходим для активации этих ферментов. Например расщепление катепсина Д производить активный короткая форма-рН зависимых¹⁰. Эти ферменты ухудшить возбудителя и посредником производства возбудителя производные короткие пептиды, которые представлены макрофагов гистосовместимости комплекс (MHC) класса II молекул клеток T, чтобы инициировать адаптивного иммунного ответа¹¹.

Следовательно фагосомы созревания имеет решающее значение для врожденный иммунный ответ и связывает врожденного и адаптивного герб иммунной системы. Это не удивительно, что патогенные организмы развивались стратегии преодоления ликвидации макрофагами через описанные выше процесс созревания фагосомы. Например внутриклеточных бактерий микобактерии туберкулеза и Legionella pneumophila предотвратить созревание фагосомы ингибирующих v АТФазы Ассамблеей и последующего люмен подкисления^12,13 . Другие бактерии, такие как Listeria monocytogenes или шигеллам Флекснера побудить порообразования в мембране фагосомы бежать в цитозоль^14,15. С другой стороны, Salmonella enterica серовар typhimurium (S. typhimurium) имеет возможность изменить свойства фагосомы в вакуоль превратить его в подходящее место для его репликации¹⁶. Эта способность делает S. typhimurium очень интересная модель для изучения возбудителя опосредованной вмешательства фагосомы созревания.

S. typhimurium является факультативной внутриклеточных бактерия, которая вызывает гастроэнтерит у людей. После вторжения lamina propria, S. Typhimurium бактерии быстро обнаруживаются и фагоцитированных макрофагами и содержащихся в phagosomes¹⁷. В некоторых докладах ранее описал что S. typhimurium-содержащих phagosomes настоящее время производители для endosomes и лизосом¹⁸, и другие исследования обнаружили фагосомы Лизосома фьюжн, предотвратить после S. Typhimurium инфекции¹⁹.

Первоначально фагосомы созревания на S. typhimurium инфекции были расследованы иммунофлуоресценции. Разработка методов для изоляции бактерий содержащих phagosomes включено более точное исследование содержания фагосомы с точки зрения endosome и лизосомальных маркеров. На сегодняшний день, основной метод, используемый для изоляции бактерий содержащих phagosomes является субцеллюлярные фракционирование сахарозы шаг градиенты^18,20. Однако этот метод требует несколько шагов центрифугирования, которые могут вызвать механические повреждения phagosomes, может повлиять на стабильность phagosomal компонентов (белков и липидов) и отнимает много времени. Кроме того, он требует использования ультрацентрифуга: кусок специализированного оборудования, который не доступен для каждой лаборатории.

Недавно, новый подход был применен к изоляции бактериальных содержащих phagosomes, в которых бактериальных патогенов помечены с биотинилированным lipopetide (Lipobiotin) и впоследствии извлечены с помощью конъюгированных стрептавидина магнитные бусы²¹ . Мы предлагаем альтернативный дополнительный метод, снабдив бактериального поверхности Амин содержащих макромолекул с ГСЗ-биотин следуют конъюгированных стрептавидина магнитные шарики. Phagosomes, полученные этим методом сильно обогащенный в endosome и лизосомальных маркеры и может быть использован для широкий спектр анализов, от анализа белка омику анализа. Кроме того она не требует специализированного оборудования, такого как Ультрацентрифуги. Кроме того устраняя шаги центрифугирования, механические повреждения phagosomes и количество времени, занятых значительно сокращаются. Этот метод может быть легко адаптирована для изоляции phagosomes, содержащие другие бактерии, такие как грамположительных Staphylococcus aureus, также включены в этой рукописи. В целом, этот метод для изоляции S. typhimurium-содержащих phagosomes является простым, экономически эффективным, и меньше времени чем классической изоляции, сахароза градиент ultracentrifugation, оказание высоко обогащенного бактерий содержащих phagosomes.