Isolamento de Salmonella typhimurium-contendo Phagosomes de macrófagos

Os macrófagos estão circulando em células fagocíticas especializadas que detectam, englobam e degradam qualquer partícula estranha presente em tecidos periféricos, variando de pilhas apoptotic a invadir microorganismos tais como bactérias. Em cima da superfície mediada reconhecimento de marcadores específicos do patógeno comumente presentes na superfície dos microorganismos (conhecido como patógeno associado a padrões moleculares ou PAMPs), macrófagos iniciar uma complexa reorganização da membrana celular em fim de cercar e phagocytize o patógeno¹.

O patógeno tragado então contido pelo macrófago em uma vesícula intracelular denominada fagossomo. Através de uma série de fusão e fissão eventos com outras vesículas como endossomos e lisossomos, o patógeno contendo fagossoma adquire um conjunto de proteínas necessárias para a eliminação do conteúdo phagosomal. Portanto, a composição enzimática do fagossomo é altamente variável no decurso deste processo, conhecido como fagossoma maturação².

Logo após a fagocitose, a complexo ATPase vacuolar (v-ATPase) da membrana do fagossomo é incorporada por fusão com endossomos³multiméricas. Este complexo utiliza ATP para bombear protões do citosol para o lúmen do fagossoma⁴. Acidificação do fagossomo é essencial para os eventos de fusão com outras vesículas⁵ e para a ativação de um grande número de enzimas degradativos dependente do pH⁶. Outra multiméricas complexo enzimático que é rapidamente montado na membrana do fagossomo é o complexo NADPH-oxidase (NOX). NOX complexo oxida NADPH para produzir espécies reativas de oxigênio (ROS) que são segregadas para o lúmen do fagossoma e que contribuem significativamente para a matança do tragado microorganismos⁷.

Durante os passos iniciais da maturação, phagosomes apresentar marcadores normalmente como Rab5 e Rab7 de endossomos cedo e tarde, respectivamente, juntamente com a subunidade de₀ V do v-ATPase⁸. Fusão de phagosomes com lisossomos e tarde endossomos resulta na exposição do patógeno fagocitada para uma grande variedade de enzimas hidrolíticas, como proteases catepsina, lipases e β-galactosidase⁹. Acidificação do lúmen é também necessária para a ativação destas enzimas. Por exemplo, a clivagem de catepsina D para produzir o formulário curto ativo é dependente do pH¹⁰. Essas enzimas degradam o patógeno e mediam a produção de derivados de patógeno peptides curtos que são apresentados pelas macrófago histocompatibilidade (MHC) classe II moléculas complexas de células T para desencadear uma resposta imune adaptativa¹¹.

Daí, maturação do fagossoma é crucial para a resposta imune inata e links braços do sistema imune inatos e adaptativos. Não é nenhuma surpresa que os patógenos desenvolveram estratégias para superar a eliminação por macrófagos pelo processo de maturação do fagossoma acima descritas. Por exemplo, a bactéria intracelular Mycobacterium tuberculosis e Legionella pneumophila impede a maturação do fagossoma inibindo v-ATPase assembly e o lúmen consequente acidificação^12,13 . Outras bactérias, como a Listeria monocytogenes ou Shigella flexneri induzem a formação de poros na membrana do fagossomo de escapar para o citosol^14,15. Por outro lado, Salmonella enterica sorovar typhimurium (S. typhimurium) é capaz de modificar as propriedades do fagossomo dentro do vacúolo para transformá-lo em um local adequado para a sua replicação¹⁶. Esta habilidade faz S. typhimurium um modelo muito interessante para estudar a interferência mediada por patógeno de maturação do fagossoma.

S. typhimurium é uma bactéria intracelular facultativo que provoca gastroenterite em seres humanos. Após a invasão da propria do lamina, S. Typhimurium bactérias são rapidamente detectadas e fagocitadas por macrófagos e contidas em phagosomes¹⁷. Alguns relatos têm descrito anteriormente que S. typhimurium-contendo phagosomes fabricantes para ambos os endossomos e lisossomos¹⁸do presente, e outros estudos encontraram fusão fagossoma-lisossoma prevenida sobre S. Typhimurium infecção¹⁹.

Inicialmente, maturação de fagossoma com S. typhimurium infecção foi investigada por microscopia de imunofluorescência. O desenvolvimento de técnicas para o isolamento de bactérias contendo phagosomes habilitado para um estudo mais preciso do conteúdo do fagossoma em termos de marcadores endossomo e lisossomo. Até à data, o principal método usado para o isolamento de bactérias contendo phagosomes é o fraccionamento subcelular em sacarose passo gradientes^18,20. No entanto, este método requer várias etapas de centrifugação que podem causar danos mecânicos ao phagosomes, podem afetar a estabilidade dos componentes phagosomal (proteínas e lipídios) e é demorado. Além disso, exige o uso de um se: um pedaço de equipamento especializado que não é acessível para todos os laboratórios.

Recentemente, uma nova abordagem foi aplicada para o isolamento de bactérias contendo phagosomes, em que os patógenos bacterianos são rotulados com lipopetide biotinilado (Lipobiotin) e mais tarde extraído usando grânulos magnéticos estreptavidina conjugada²¹ . Propomos um método alternativo complementar através da marcação de macromoléculas contendo amina superfície bacterianas com NHS-biotina seguido por grânulos magnéticos estreptavidina conjugada. Phagosomes obtidos por esse método são altamente enriquecidos em marcadores endossomo e lisossoma e podem ser usados para uma ampla gama de ensaios, de análise de proteínas para análise omics. Além disso, não requer equipamento especializado como ultracentrifuges. Além disso, eliminando as etapas de centrifugação, tanto os danos mecânicos à phagosomes e a quantidade de tempo empregado são consideravelmente reduzidos. Esse método pode ser facilmente adaptado para o isolamento de phagosomes contendo outras bactérias, tais como o Gram-positivas Staphylococcus aureus, também incluído neste manuscrito. Em resumo, este método para o isolamento de S. typhimurium-contendo phagosomes é um simples, econômico, e menos demorada do que a clássico isolamento por sacarose gradiente-ultracentrifugação, tornando-se altamente enriquecido contendo bactérias phagosomes.