Aislamiento de Salmonella typhimurium-que contienen fagosomas de los macrófagos

Los macrófagos circulan células fagocíticas especializadas que detectan, fagocitan y degradarán cualquier partícula extranjera presente en los tejidos periféricos, que van desde células apoptóticas a la invasión de microorganismos como las bacterias. Sobre superficie receptor-medió el reconocimiento de marcadores específicos del patógeno comúnmente presentes en la superficie de los microorganismos (conocido como patrones moleculares asociados a patógenos PAMPs), los macrófagos inician una reorganización compleja de la membrana celular en orden para rodear y fagocitan el patógeno¹.

El patógeno engulló entonces contenido por el macrófago en una vesícula intracelular denominada fagosoma. A través de una serie de eventos de fisión con otras vesículas de endosomas y lisosomas y fusión, el fagosoma que contiene el patógeno adquiere un conjunto de proteínas necesario para la eliminación del contenido phagosomal. Por lo tanto, la composición enzimática del fagosoma es altamente variable en el transcurso de este proceso, conocido como de la maduración del fagosoma².

Poco después de la fagocitosis, la multimérica Complejo ATPasa vacuolar (v-ATPasa) se incorpora a la membrana del fagosoma por fusión con endosomas³. Este complejo utiliza ATP para protones bomba desde el citosol al lumen del fagosoma⁴. Acidificación del fagosoma es esencial para los eventos de fusión con otras vesículas⁵ y para la activación de un gran número de enzimas degradativas dependiente de pH⁶. Otro complejo enzimático multimérica que rápidamente se ensambla en la membrana del fagosoma es el complejo NADPH-oxidasa (NOX). NOX complejo oxida NADPH para producir especies reactivas del oxígeno (ROS) que se secretan en el lumen del fagosoma y que contribuyen significativamente a la muerte de los microorganismos ingieren⁷.

Durante los pasos iniciales de la maduración, fagosomas presentan marcadores típicamente como Rab5 y Rab7 de endosomas temprano y tardío respectivamente junto con la subunidad de₀ V de la v-ATPasa⁸. Fusión de los fagosomas con los lisosomas y endosomas finales resulta en la exposición del patógeno fagocitado a una gran variedad de enzimas hidrolíticas tales como lipasas y proteasas catepsina y β-galactosidasa⁹. Acidificación del lumen también se requiere para la activación de estas enzimas. Por ejemplo, el escote de catepsina D para producir la forma corta activa es dependiente de pH¹⁰. Estas enzimas degradan el patógeno y median la producción de péptidos derivados del patógeno cortos que son presentados por el macrófago de histocompatibilidad (MHC) clase II moléculas complejas a las células T para desencadenar una respuesta inmune adaptativa¹¹.

Por lo tanto, la maduración del fagosoma es crucial para la respuesta inmunitaria innata y une los brazos del sistema inmune innatos y adaptativos. No es de sorprender que los patógenos han desarrollado estrategias para superar la eliminación por los macrófagos a través del proceso anteriormente descrito de la maduración del fagosoma. Por ejemplo, la bacteria intracelular tuberculosis del Mycobacterium y Legionella pneumophila prevenir la maduración del fagosoma por Asamblea de v-ATPase inhibidor y lumen consecuente acidificación^12,13 . Otras bacterias como la Listeria monocytogenes o Shigella flexneri inducen la formación de poros en la membrana del fagosoma para escapar en el citosol^14,15. Por otra parte, Salmonella enterica serovar typhimurium (S. typhimurium) es capaz de modificar las propiedades del fagosoma dentro de la vacuola para transformarlo en un lugar adecuado para su replicación¹⁶. Esta capacidad hace S. typhimurium un modelo muy interesante para estudiar la interferencia mediada por el patógeno de la maduración del fagosoma.

S. typhimurium es una bacteria intracelular facultativa que produce gastroenteritis en humanos. Después de invasión de la lámina propia, S. Bacterias typhimurium son rápidamente detectadas y fagocitadas por los macrófagos y dentro de fagosomas¹⁷. Algunos informes han descrito previamente S. typhimurium-fagosomas que contienen actualmente los fabricantes de endosomas y lisosomas¹⁸, y otros estudios han encontrado la fusión fagosoma-lisosoma prevenida sobre S. De la infección typhimurium¹⁹.

Inicialmente, maduración de fagosoma al S. la infección typhimurium ha sido investigada por microscopia de la inmunofluorescencia. El desarrollo de técnicas para el aislamiento de las bacterias que contienen fagosomas permitió un estudio más preciso del contenido en términos de marcadores endosome y lisosoma fagosoma. Hasta la fecha, el método principal utilizado para el aislamiento de las bacterias que contienen fagosomas es el fraccionamiento subcelular en sacarosa paso gradientes^18,20. Sin embargo, este método requiere varios pasos de centrifugación que pueden causar daños mecánicos en fagosomas, pueden afectar la estabilidad de phagosomal componentes (proteínas y lípidos) y consume tiempo. Por otra parte, requiere el uso de una ultracentrífuga: una pieza de equipo especializado que no es accesible para cada laboratorio.

Recientemente, se ha aplicado un nuevo enfoque para el aislamiento de bacterias que contienen fagosomas, en la que bacterias patógenas están marcados con lipopetide biotinilado (Lipobiotin) y más tarde extrajeron usando bolas magnéticas conjugado estreptavidina²¹ . Proponemos un método alternativo complementario por etiquetado bacterianas superficiales macromoléculas que contienen amina con NHS-biotina seguido de bolas magnéticas conjugado estreptavidina. Fagosomas obtenidos por este método son altamente enriquecidos en marcadores endosome y lisosoma y pueden utilizarse para una amplia gama de ensayos, de análisis de proteínas para análisis ómicas. Además, no requiere equipo especializado como ultracentrífugas. Por otra parte, mediante la eliminación de los pasos de centrifugación, el daño mecánico a los fagosomas y la cantidad de tiempo empleado se reducen considerablemente. Este método se puede adaptar fácilmente para el aislamiento de los fagosomas que contienen otras bacterias como la gram-positivos Staphylococcus aureus, incluido también en este manuscrito. En Resumen, este método para el aislamiento de S. typhimurium-que contienen fagosomas es un simple, rentable, y menos consumo de tiempo que el aislamiento clásico de sacarosa gradiente-ultracentrifugación, representación altamente enriquecido fagosomas que contienen bacterias.