Isolierung von Salmonella Typhimurium-mit Phagosom von Makrophagen

Makrophagen im Umlauf sind spezialisierter phagocytic Zellen, die erkennen, verschlingen und Fremdkörper in peripheren Geweben, von apoptotischen Zellen bis hin zu eindringenden Mikroorganismen wie Bakterien abgebaut. Auf Oberfläche Rezeptor-vermittelte Anerkennung Erreger spezifischer Marker auf der Oberfläche von Mikroorganismen (bekannt als Pathogen-assoziierte molekulare Muster oder PAMPs) häufig vorhanden initiieren Makrophagen eine komplexe Reorganisation der Zellmembran in Bestellung zu umgeben und phagocytize der Erreger-¹.

Die verschlungen Erreger ist dann durch die Makrophagen in einem intrazellulären Vesikel genannt Phagosom enthalten. Durch eine Reihe von Kernfusion und Kernspaltung Veranstaltungen mit anderen Vesikel wie Endosomen und Lysosomen erwirbt die Erreger-haltigen Phagosom eine Reihe von Proteinen, die für die Beseitigung des phagosomal Inhalts erforderlich. Daher ist die enzymatische Zusammensetzung der Phagosom im Laufe dieses Prozesses, bekannt als Phagosom Reifung²sehr variabel.

Kurz nach der Phagozytose, Multimeric, die komplexe vacuolar ATPase (V-ATPase) durch Fusion mit Endosomen³Phagosom Membran integriert ist. Die Anlage nutzt ATP zu Pumpe Protonen aus dem Zytosol in das Lumen der Phagosom⁴. Versauerung der Phagosom ist unerlässlich für die Fusion-Veranstaltungen mit anderen Vesikel⁵ und für die Aktivierung einer großen Anzahl von pH-abhängigen abbauende Enzyme⁶. Ein weiterer Multimeric enzymatischen Komplex, die schnell auf der Membran Phagosom montiert ist ist der NADPH-Oxidase (NOX) Komplex. Komplexe NOX oxidiert NADPH um reaktive Sauerstoffspezies (ROS), werden in das Phagosom Lumen abgesondert und, die wesentlich dazu beitragen, die Tötung der verschlungen Mikroorganismen^7,zu produzieren.

Während die ersten Schritte der Reifung präsentieren Phagosom Marker in der Regel wie Rab5 und Rab7 der frühen und späten Endosomen bzw. zusammen mit der V-₀ -Untereinheit des V-ATPase⁸. Fusion von Phagosom mit Lysosomen und späten Endosomen führt die Belichtung der phagocytized Erreger, eine Vielzahl von hydrolytische Enzyme wie Cathepsin Proteasen, Lipasen und β-Galaktosidase⁹. Versauerung des lumens ist auch erforderlich für die Aktivierung dieser Enzyme. Beispielsweise ist die Spaltung von Cathepsin D, die aktive Kurzform zu produzieren pH-abhängigen¹⁰. Diese Enzyme erniedrigen den Erreger und vermitteln die Herstellung von Pathogen-abgeleitete kurze Peptide, die durch die Makrophagen große Histocompatibility Komplexes (MHC) Klasse II Moleküle auf T-Zellen eine adaptive Immunantwort¹¹auslösen dargestellt werden.

Daher Phagosom Reifung ist entscheidend für die angeborene Immunantwort und verbindet die angeborene und adaptive Waffen des Immunsystems. Es ist keine Überraschung, dass die Erreger Strategien zur Beseitigung von Makrophagen durch den oben beschriebenen Prozess der Reifung Phagosom Überwindung entwickelt haben. Beispielsweise verhindert die intrazellulären Bakterien Mycobacterium Tuberculosis und Legionella Pneumophila Phagosom Reifung durch hemmende V-ATPase Montage- und konsequente Lumen Versauerung^12,13 . Andere Bakterien wie Listeria Monocytogenes oder Shigella Flexneri induzieren Porenbildung in der Phagosom Membran in die Zellflüssigkeit^14,15zu entkommen. Auf der anderen Seite, Salmonella Enterica Serovar Typhimurium (S. Typhimurium) zum Ändern der Eigenschaften von Phagosom in die Vakuole, es in einen geeigneten Standort für ihre Replikation¹⁶verwandeln kann. Diese Fähigkeit macht S. Typhimurium ein sehr interessantes Modell Erreger-vermittelte Störungen von Phagosom Reifung zu studieren.

S. Typhimurium ist ein fakultativ intrazellulären Bakterium, das Gastroenteritis beim Menschen verursacht. Nach der Invasion der Lamina Propria, S. Typhimurium Bakterien werden schnell erkannt und durch Makrophagen phagozytiert und enthaltenen Phagosom¹⁷. Einige Berichte haben, dass S. oben beschrieben. Typhimurium-enthaltenden Phagosom präsentieren Hersteller für Endosomen und Lysosomen¹⁸, und andere Studien ergaben Phagosom-Lysosomen Fusion verhindert auf S. Typhimurium Infektion¹⁹.

Zunächst Phagosom Reifung auf S. Typhimurium Infektion ist durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie untersucht worden. Die Entwicklung von Techniken für die Isolierung der Bakterien-haltigen Phagosom ermöglichte eine genauere Studie über das Phagosom Inhalte in Bezug auf Endosom und Lysosomen Marker. Bis heute ist die main-Methode verwendet für die Isolierung der Bakterien-haltigen Phagosom ist der subzellulären Fraktionierung auf Saccharose Schritt Steigungen^18,20. Diese Methode erfordert jedoch mehrere Zentrifugation Schritte, die Phagosom mechanische beschädigen können, beeinflussen die Stabilität der phagosomal Komponenten (Proteine und Lipide) und nimmt Zeit in Anspruch. Darüber hinaus erfordert die Verwendung einer Ultrazentrifuge: ein Stück von Spezialausrüstungen, die nicht für jedes Labor zugänglich ist.

Vor kurzem ein neuer Ansatz zur Isolierung der Bakterien-haltigen angewendet wurde Phagosom, in denen bakterielle Erreger mit biotinylierte Lipopetide (Lipobiotin) und später beschriftet sind mit Streptavidin-konjugiert magnetische Beads^{21 extrahiert} . Wir schlagen eine alternative komplementäre Methode durch bakterielle Oberfläche Amin-haltigen Makromoleküle mit NHS-Biotin labeling von Streptavidin konjugiert magnetische Beads gefolgt. Phagosom erhalten durch diese Methode sind hochangereichertes im Endosom und Lysosomen Marker und können für eine breite Palette von Assays aus Protein-Analyse, Analyse der Omics verwendet werden. Darüber hinaus erfordert es keine Spezialausrüstung wie Ultrazentrifugen. Darüber hinaus werden durch den Wegfall der Zentrifugation Schritte, die mechanische Beschädigung Phagosom und der Höhe der Zeit beschäftigt erheblich reduziert. Diese Methode kann leicht für die Isolierung von Phagosom mit anderen Bakterien, wie z. B. die grampositive Staphylococcus Aureus, ebenfalls in dieser Handschrift angepasst werden. Fazit: Diese Methode für die Isolierung von S. Typhimurium-mit Phagosom ist eine einfache, kostengünstige, und weniger zeitaufwändig als die klassische Trennung von Saccharose Farbverlauf-Ultrazentrifugation, Rendern sehr bereichert Bakterien-haltigen Phagosom.