Summary

サルモネラの分離-大食細胞のファゴゾームを含む

Published: October 25, 2017
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Summary

簡単で迅速なサルモネラの分離法をご紹介-ビオチンとストレプトアビジン菌をコーティングすることによりマクロファージからファゴゾームを含みます。

Abstract

サルモネラは、人間の胃腸炎を引き起こす通性細胞内細菌です。粘膜、S.の侵略の後ネズミチフス菌迅速検出し貧するの大食細胞によって、低下するためファゴゾームと呼ばれる小胞に含まれています。Sの分離ネズミチフス菌-含むファゴゾームは、広く研究に使用されているどのようにs.感染症は、細菌の劣化を防ぐためファゴソーム成熟のプロセスを変更します。細菌を含む分離従来、ファゴゾーム ショ糖勾配遠心法によって実行されました。ただし、このプロセスは時間がかかり、専用の装置とある程度の器用さが必要です。Sの分離の簡単かつ迅速な方法は、ここで説明しました。ネズミチフス菌-ビオチン-ストレプトアビジン共役磁気ビーズの細菌をコーティングすることによりマクロファージからファゴゾームを含みます。分離ファゴゾーム アッセイ、脂質、代謝、タンパク質解析などの広い範囲のための利用可能の選択の任意のバッファーで本法で得られたファゴゾームを中断できます。要約すると、このSの分離法ネズミチフス菌の特定、効率的、迅速なファゴゾームを含む最低限の機器を必要とする、古典的なショ糖勾配超遠心分離法よりも汎用性が。

Introduction

マクロファージ循環専門の貪食細胞検出、巻き込む、および任意の異物侵入の細菌など微生物細胞のアポトーシスに至る末梢の組織内に存在の低下しています。一般微生物 (病原体関連分子パターンまたは PAMPs として知られている) の表面に存在する病原体特定マーカーの表面受容体を介した認識時にマクロファージを開始の細胞膜における複雑な再編囲むと病原体1を phagocytize の順。

包まれて病原体、ファゴソームと呼ばれる細胞内小胞のマクロファージによって含まれています。エンドソーム、リソソームなど他の小胞の分裂と融合の一連、病原体を含むファゴソームは組の phagosomal コンテンツの除去に必要な蛋白質を取得します。したがって、ファゴソームの酵素の組成は、ファゴソーム成熟2として知られているこのプロセスの過程で非常に可変です。

直後に貪食、エンドソーム3融解によるファゴソーム膜を組み込む複雑な空胞 ATPase (V-atpase) ポリコームタンパク。この複合体は、ファゴソーム4ルーメンに細胞質からポンプのプロトンに ATP を利用しています。ファゴソームの酸性化は、5その他の小胞の融合イベントおよび pH 依存分解酵素6の偉大な数の活性化が不可欠です。別ポリコームタンパク酵素複合体ファゴソーム膜上に組み立てはすぐに NADPH オキシダーゼ (NOX) 複合体であります。複雑な NOX は、ファゴソームの内腔に分泌して包まれて微生物7の殺害に大幅に貢献する活性酸素種 (ROS) を生成するために NADPH を酸化させます。

成熟の最初の手順では、ファゴゾームは通常 Rab5 など v ATPase8V0サブユニットと共にそれぞれの初期と後期エンドソームの Rab7 マーカーを提示します。リソソームと後期エンドソーム ファゴゾームの融合貧するの病原体のさまざまな加水分解酵素カテプシン プロテアーゼ、リパーゼ、β-ガラクトシダーゼ9などへの暴露で起因します。内腔の酸性化もこれらの酵素の活性化のために必要です。たとえば、アクティブな短いフォームを生成するカテプシン D の胸の谷間は pH 依存性10です。これらの酵素は、病原体が低下してマクロファージ主要組織適合遺伝子複雑な (MHC) クラス II 分子11適応免疫応答をトリガーする T 細胞に提示された病原体由来のペプチドの生産を仲介します。

したがって、ファゴソーム成熟は生得の免疫反応のため非常に重要ですし、自然免疫と適応免疫システムの腕をリンクします。病原体はファゴソーム成熟の上記プロセスを介してマクロファージによって除去を克服する戦略を進化している驚きではないです。たとえば、細胞内細菌結核菌レジオネラ ・ ニューモフィラ防止抑制 V-atpase アセンブリとそれに伴う内腔の酸性化12,13 によるファゴソーム成熟.リステリア菌赤痢菌など他の細菌は、細胞質14,15に脱出するファゴソーム膜の細孔形成を誘発します。その一方で、サルモネラ血清型ネズミチフス菌(Sネズミチフス菌)そのレプリケーション16の適切な場所に変換する液胞内ファゴソームのプロパティを変更することです。この機能によって、 s.ネズミチフス菌ファゴソーム成熟の病原体を介した干渉を研究する非常に興味深いモデル。

ネズミチフス菌は通性細胞内細菌人間の胃腸炎を引き起こすです。粘膜、 s.の侵略の後ネズミチフス菌迅速検出し貧するの大食細胞によっておよびファゴゾーム17の内で含まれています。いくつかのレポートはそのs.を前述しました。ネズミチフス菌-エンドソーム、リソソームは18メーカーで示し、他の研究は、に防いだファゴソームとリソソームの融合を発見した含んでいる phagosomeネズミチフス菌感染症19

S.によって最初に、ファゴソーム成熟蛍光顕微鏡による感染症について調べた。細菌を含む分離技術の開発ファゴゾームはエンドソームやライソソーム マーカー ファゴソーム内容のより正確な研究を有効にします。までに、主要な細菌を含む分離使用方法ファゴゾームはショ糖ステップ グラデーション18,20細胞レベル下の分別。ただし、このメソッドは、ファゴゾームに機械的な損傷を引き起こす可能性が、phagosomal コンポーネント (蛋白質・脂質) の安定性に影響を与えることができます、時間がかかる複数の遠心分離手順を必要です。また、それは、超遠心機の使用を必要です: は、アクセスできないすべての研究室の専門機器の一部。

最近では、新しいアプローチは、細菌を含む分離に適用されている phagosome、ビオチン化 lipopetide (Lipobiotin) と後に細菌性病原体は、ラベル付けは、ストレプトアビジン共役磁気ビーズ21 を使用して抽出.磁気ビーズのストレプトアビジン共役続いて NHS ビオチンと細菌表面アミン含有高分子の分類によって相補的な方法を提案します。本法で得られたファゴゾーム エンドソームやライソソーム マーカーで濃縮され非常とアッセイ、オミックス解析タンパク質解析からの広い範囲に使用できます。さらに、ultracentrifuges などの特殊な機器は不要です。また、遠心分離手順を排除し、ファゴゾームに機械的な損傷や採用時の量が大幅に削減します。このメソッドは、グラム陽性球菌、この原稿にも含まれているなど、他の細菌を含むファゴゾームの隔離のために簡単に対応できます。要約すると、このSの分離法ネズミチフス菌-ファゴゾームを含む、シンプルでコスト効率の高い、ショ糖で古典的な分離より時間もかかります以下勾配遠心、高度のレンダリング濃縮細菌含むファゴゾーム。

Protocol

病原性 s. の使用を含むすべての手順ネズミチフス菌 は、BSL 2 またはより高い生物学的セキュリティ レベルの施設で実施する必要があります。文化と S のコーティングネズミチフス菌として骨髄由来マクロファージ (BMDMs) の感染は、汚染を防ぐための層流フードの下で行う必要があります。S の分離ネズミチフス菌-ファゴゾームを含む任意 BSL 2 実験室ベン?…

Representative Results

細菌を含む分離このプロトコルによってファゴゾーム細菌の最初のステップとしてビオチン化が必要です。我々 したがって、 s.の有効性を評価ビオチン標識に感染した BMDMs の共焦点顕微鏡解析によるネズミチフス菌ビオチン化 mCherry-S。ネズミチフス菌Cy5 ストレプトアビジンが付いた。簡単に、BMDMs は、mCherry-Sとこのプロトコルで説…

Discussion

新しいSの分離法ネズミチフス菌-ここで説明はファゴゾームを含むビオチンとストレプトアビジン共役磁気ビーズ細菌をコーティングします。細胞膜の穏やかな中断の後、磁気ラックを使用して細菌を含むファゴゾームできます簡単に抽出しました。示す細菌の炎症を誘発する病原体の能力を維持宿主細胞の貪食のプロパティは変更されません。このメソッドによって得られる?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Aging-Associated 病、ケルン大学、ドイツの細胞ストレス反応にケルンの卓越性クラスターからの資金調達でロビンソンのラボで研究をサポート (CECAD; エクセレンス イニシアチブは、ドイツ連邦内 DFG によって資金を供給し、国家の政府) とドイツ研究振興協会 (SFB 670)、ケルン富と、ドイツのケルン大学のマリア ペッシュ財団からの助成金。

Materials

EZ-Link NHS Biotin Thermo Fisher Scientific 20217
FluidMag Streptavidin Chemicell 4205
PIPES Carl Roth 9156.2
MgCl2 Carl Roth A537.4
EGTA Carl Roth 3054.3
Sucrose Carl Roth 4621.1
Mannitol Carl Roth 4175.1
DTT Sigma 43816
Halt Protease and Phosphatase inhibitor cocktail Thermo Fisher Scientific 1861280
Cytochalasin B Sigma C6762
DYNAL or DynaMag Magnet Thermo Fisher Scientific 12321D
SmartSpec 3000 Spectrophotometer Bio-Rad 170-2501
Bacterial loop (10µl) Sarstedt 86.1562.010
Salmonella enterica serovar Typhimurium SL1344 Leibniz Institute DSMZ-German collection of Microorganisms and Cell Cultures
RPMI Biochrom FG1415
PBS Biochrom L1825
Cy5-streptavidin Invitrogen SA1011
anti-beta-actin antibody Santa Cruz Biotechnology sc-47778
anti-mCherry antibody Thermo Fisher Scientific PA5-34974
anti-Rab5 antibody Santa Cruz Biotechnology sc-46692
anti-Rab7 antibody Santa Cruz Biotechnology sc-10764
anti-v-ATPase (V0) antibody Santa Cruz Biotechnology sc-28801
anti-v-ATPase (V1) antibody Santa Cruz Biotechnology sc-20943
anti-cathepsin D antibody Santa Cruz Biotechnology sc-6486
anti-Tomm20 antibody Santa Cruz Biotechnology sc-17764
anti-calnexin antibody Santa Cruz Biotechnology sc-46669
anti-GAPDH antibody Santa Cruz Biotechnology sc-20357

References

  1. Freeman, S. A., Grinstein, S. Phagocytosis: receptors, signal integration, and the cytoskeleton. Immunol Rev. 262 (1), 193-215 (2014).
  2. Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. Phagosome maturation: going through the acid test. Nat Rev Mol Cell Bio. 9 (10), 781-795 (2008).
  3. Lafourcade, C., Sobo, K., Kieffer-Jaquinod, S., Garin, J., van der Goot, F. G. Regulation of the V-ATPase along the Endocytic Pathway Occurs through Reversible Subunit Association and Membrane Localization. Plos One. 3 (7), e2758 (2008).
  4. Forgac, M. Vacuolar ATPases: rotary proton pumps in physiology and pathophysiology. Nat Rev Mol Cell Bio. 8 (11), 917-929 (2007).
  5. Marshansky, V., Futai, M. The V-type H+-ATPase in vesicular trafficking: targeting, regulation and function. Curr Opin Cell Biol. 20 (4), 415-426 (2008).
  6. Ullrich, H. J., Beatty, W. L., Russell, D. G. Direct delivery of procathepsin D to phagosomes: Implications for phagosome biogenesis and parasitism by Mycobacterium. Eur J Cell Biol. 78 (10), 739-748 (1999).
  7. Bedard, K., Krause, K. H. The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: Physiology and pathophysiology. Physiol Rev. 87 (1), 245-313 (2007).
  8. Haas, A. The phagosome: Compartment with a license to kill. Traffic. 8 (4), 311-330 (2007).
  9. Scott, C. C., Botelho, R. J., Grinstein, S. Phagosome maturation: A few bugs in the system. J Membrane Biol. 193 (3), 137-152 (2003).
  10. Turk, V., et al. Cysteine cathepsins: From structure, function and regulation to new frontiers. Bba-Proteins Proteom. 1824 (1), 68-88 (2012).
  11. Ramachandra, L., Song, R., Harding, C. V. Class II MHC molecules and peptide complexes appear in phagosomes during phagocytic antigen processing. Faseb J. 12 (4), A589-A589 (1998).
  12. Robinson, N., et al. Mycobacterial Phenolic Glycolipid Inhibits Phagosome Maturation and Subverts the Pro-inflammatory Cytokine Response. Traffic. 9 (11), 1936-1947 (2008).
  13. Clemens, D. L., Lee, B. Y., Horwitz, M. A. Mycobacterium tuberculosis and Legionella pneumophila phagosomes exhibit arrested maturation despite acquisition of Rab7. Infect Immun. 68 (9), 5154-5166 (2000).
  14. Smith, G. A., et al. The two distinct phospholipases C of Listeria monocytogenes have overlapping roles in escape from a vacuole and cell-to-cell spread. Infect Immun. 63 (11), 4231-4237 (1995).
  15. Woolard, M. D., Frelinger, J. A. Outsmarting the host: bacteria modulating the immune response. Immunol Res. 41 (3), 188-202 (2008).
  16. Gallois, A., Klein, J. R., Allen, L. A. H., Jones, B. D., Nauseef, W. M. Salmonella pathogenicity island 2-encoded type III secretion system mediates exclusion of NADPH oxidase assembly from the phagosomal membrane. J Immunol. 166 (9), 5741-5748 (2001).
  17. Ohl, M. E., Miller, S. I. Salmonella: A model for bacterial pathogenesis. Annu Rev Med. 52, 259-274 (2001).
  18. Mills, S. D., Finlay, B. B. Isolation and characterization of Salmonella typhimurium and Yersinia pseudotuberculosis-containing phagosomes from infected mouse macrophages: Y-pseudotuberculosis traffics to terminal lysosomes where they are degraded. Eur J Cell Biol. 77 (1), 35-47 (1998).
  19. Buchmeier, N. A., Heffron, F. Inhibition of Macrophage Phagosome-Lysosome Fusion by Salmonella-Typhimurium. Infect Immun. 59 (7), 2232-2238 (1991).
  20. Luhrmann, A., Haas, A. A method to purify bacteria-containing phagosomes from infected macrophages. Methods Cell Sci. 22 (4), 329-341 (2000).
  21. Steinhauser, C., et al. Lipid-labeling facilitates a novel magnetic isolation procedure to characterize pathogen-containing phagosomes. Traffic. 14 (3), 321-336 (2013).
  22. Weischenfeldt, J., Porse, B. Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications. CSH Protoc. 2008, (2008).
  23. Detilleux, P. G., Deyoe, B. L., Cheville, N. F. Entry and intracellular localization of Brucella spp. in Vero cells: fluorescence and electron microscopy. Vet Pathol. 27 (5), 317-328 (1990).
  24. Arenas, G. N., Staskevich, A. S., Aballay, A., Mayorga, L. S. Intracellular trafficking of Brucella abortus in J774 macrophages. Infect Immun. 68 (7), 4255-4263 (2000).
  25. West, A. P., et al. TLR signalling augments macrophage bactericidal activity through mitochondrial ROS. Nature. 472 (7344), 476-480 (2011).
  26. Li, Q., Jagannath, C., Rao, P. K., Singh, C. R., Lostumbo, G. Analysis of phagosomal proteomes: from latex-bead to bacterial phagosomes. Proteomics. 10 (22), 4098-4116 (2010).
  27. Rao, P. K., Singh, C. R., Jagannath, C., Li, Q. A systems biology approach to study the phagosomal proteome modulated by mycobacterial infections. Int J Clin Exp Med. 2 (3), 233-247 (2009).
  28. Rogers, L. D., Foster, L. J. The dynamic phagosomal proteome and the contribution of the endoplasmic reticulum. P Natl Acad Sci USA. 104 (47), 18520-18525 (2007).

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Gutiérrez, S., Wolke, M., Plum, G., Robinson, N. Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages. J. Vis. Exp. (128), e56514, doi:10.3791/56514 (2017).

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