В этом протоколе мы описывают методы для надлежащего вскрытия Arabidopsis цветов и siliques, некоторые методы расчистки основных и выбрали пятнать процедуры для наблюдений в целом гора репродуктивных структур.
Благодаря своей грозной инструменты для молекулярно-генетические исследования Arabidopsis thaliana является одним из наиболее известных видов модели в биологии растений и, особенно, репродуктивной биологии растений. Однако завод морфологических, анатомические и ультраструктурные анализ традиционно включает длительным встраивание и секционирование процедуры светлые области, сканирование и электронной микроскопии. Недавний прогресс в конфокальных флуоресцентной микроскопии, 3-D-искусство автоматизированного микроскопические анализы и непрерывное совершенствование молекулярных методов для использования на минимально обработанных образцов состава Гора, привело к увеличению спроса на Разработка эффективных и минимальный пример методов обработки. В этом протоколе мы описываем методы для правильно рассечения Arabidopsis цветы и siliques, основной очистки методы, и некоторые окрашивание процедур для всего гора наблюдений репродуктивных структур.
Цветы одним из наиболее важных определение органов покрытосеменных растений. Цветковых растений появились около 90-130 миллионов лет назад1и диверсифицированной так быстро, что их быстрое появление был описан как «ужасные тайны» Чарльза Дарвина2. Разнообразны интересы завода исследователей в цветок развития. Некоторые исследования были направлены на понимание эволюционного происхождения цветок в целом, или эволюция определенных анатомических, структурных и функциональных свойств цветы3,4,5,6 . Высокая вариация в цветочные формы и структуры, а также виды сексуального и бесполого размножения, опираясь на них, сделать цветок очень сложную структуру. Это привело к разнообразные усилия для характеризуют анатомии и структурные особенности цветочные органов, используя свет и электрон микроскопические методы, которые можно было бы объединить с генетические и молекулярные исследования7. Кроме того, как источник плоды и семена Цветки имеют первостепенное значение для человека и животных питания. Таким образом характеристика развития цветка и плода имеет множество последствий для прикладных исследований, в том числе продовольственной безопасности растущего населения и сохранения экологических стратегий в рамках меняющейся окружающей среды8 , 9 , 10.
Цветок развития в проростках Arabidopsis начинается с цветок индукции и преобразование вегетативного Меристемы на Меристемы соцветия (группа цветов). Цветок Примордия инициируются боково на фланге соцветия Меристемы11. Примордия цветочные орган постепенно формируют концентрические мутовках от снаружи к центру цветка и в конечном итоге превратиться в7чашелистики, лепестки, тычинки и плодолистиков. Эти цветочные органов выполнять собственный питательная, защитных и функциональных (например, привлечение опылителей) ролей в различных видов растений, с половыми органами, устойчивого развития мужских и женских gametophytes, соответственно12 , 13. gametophytes, в свою очередь, каждый дифференцировать пару мужчин (спермы) и женские гаметы (яйца и центральная ячейка), которые объединяют по двойной оплодотворения в форме следующего поколения, зиготы и основной эндосперма, поддержка терминалов ткани развитие эмбриона14,15. Плоды и семена развития поддержки роста, созревания и сохранение эмбриона и, в конечном счете, ее разгон. Обширные исследования была выполнена характеризовать цветок и развития эмбриона в видов различных растений, особенно в модели вида Arabidopsis7,16,17.
Ранние микроскопические анализы цветок развития были основаны на времени пример обработки и наблюдения, что методы, такие как парафин или встраивание смолы и секционирование, в сочетании с легкими или электронной микроскопии. Эти традиционные микроскопические методы были часто используется в сочетании с молекулярные генетические исследования, такие как микроскопические анализы мутантов, локализация РНК путем в situ гибридизация или иммуно обнаружение белков. Недавний прогресс в-поля и конфокальный флуоресцентной микроскопии, в состояние искусства трехмерного компьютерного изображения анализы и непрерывное совершенствование молекулярных методов, которые могут быть использованы на минимально обработанных образцов состава Гора, привело к необходимости методы обработки образца эффективной и минимальным, которые поддаются преференциально количественного анализа. В последние годы был достигнут значительный прогресс в развитии методов очистки на целом гора животных образца. Они транспарентности образца либо с помощью водного раствора мочевины – или на основе сахара реагенты (например, масштаб, SeeDB, КУБИЧЕСКИЙ)18,19,20, или выборочно удалить липидов (с использованием моющего средства SDS) после Встраивание образцов в стабильных гидрогели; удаление липидов может быть достигнуто либо путем пассивной диффузии (например, изменение ЯСНОСТИ протокол21, Пакт-ПАРС-колеса22) или активно электрофорезом (оригинал ЯСНОСТИ протокол23 и акт-вуаля24). Воодушевленные этой быстрый прогресс, некоторые производные методы появляются также для использования в растениях.
В этом документе методы сосредоточены на модели Arabidopsisмы описываем порядок надлежащего вскрытия бутонов, цветов, и молодые siliques и очистки всего гора образцов для разнообразной окраски и процедуры наблюдения с помощью Классическая или недавно метод очистки на базе ИКБ. Даны примеры крахмал, callose и окрашивание хроматина. Хотя эти процедуры может понадобиться дальнейшего улучшения и адаптации при использовании с другими видами, мы надеемся, что они будут почву для дальнейших исследований на этих простых, но важных методов, которые являются отправной точкой многих научно-исследовательских проектов.
Существование многих бутоны в пределах одного соцветия Arabidopsis, охватывающей все этапы развития цветок, предлагает уникальную возможность для исследований, направленных на характеристике эффект лечения или функцию развития одновременно через различные этапы развития цветка. Хор…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана университета Цюриха, МЭФ Мари Кюри Грант (Грант нет. TransEpigen-254797 года хиджры), расширенный грант Европейского исследовательского совета (Грант нет. Medea-250358 уг) и исследования и разработки технологий проект (Грант MecanX уг) от SystemsX.ch, швейцарская инициатива по биологии систем.
Reagents and Materials | |||
Ethanol | Scharlau | ET00102500 | |
Acetic Acid | Applichem | A3686,2500 | 100% Molecular biology grade |
Glacial Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 320099 | Molecular Biology Grade |
Methanol | Scharlau | ME03062500 | |
Formaldehyde Solution | Sigma-Aldrich | F1635 | |
Propionic acid | Sigma-Aldrich | 81910-250 ml | |
Chloral hydrate | Sigma-Aldrich | 15307 | |
Glycerol | Roth | 3783.1 | |
Gum arabic | Fluka | 51198 | |
Lactic acid | Fluka | 69773 | |
Phenol | Sigma-Aldrich | 77607-250ML | We used liquid phenol (use the density to find the required volume for your solution) |
Clove oil | Sigma-Aldrich | C8392-100ML | |
Xylene | Roth | 4436.1 | |
Iodine | Fluka | 57665 | |
Potassium iodide | Merck | 5043 | |
Malachite Green | Fluka | 63160 | |
Fuchsin acid | Fluka | 84600 | |
Orange G | Sigma | 7252 | |
Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | Molecular Biology Grade |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 71690 | |
Sodium di-Hydrogen Phosphate | Applichem | A1047,1000 | |
Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S9763-1KG | |
Potassium phosphate | Sigma-Aldrich | 04347 | |
EDTA | Applichem | A2937,1000 | |
Calcofluor | Sigma | F6259 | Fluorescent brightener 28 |
Auramine | Chroma | 10120 | |
DAPI | Sigma | D9542 | toxic |
Triton-X-100 | Sigma | T8787 | |
Aniline blue | Merck | 1275 | |
MS medium | Carolina | 19-57030 | |
Nutrient-rich substrate | Einheitserde | ED73 | |
Watch maker's glass | No specific brand | ||
15 ml falcon centrifuge tubes | VWR | 62406-200 | |
Dumond Forceps | Actimed | 0208-5SPSF-PS | |
Forceps | DUMONT BIOLOGY | 0108-5 | |
Syringe | BD | BD Plastipak 300013 | 1 ml |
Preparation needle | BD | BD Microlance 304000 | |
Microscope slides | Thermo Scientific | 10143562CE | cut edges |
Coverslips | Thermo Scientific | DV40008 | |
Humid box | A plastic box with damp paper towel and slide supports inside | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Solutions | |||
Fixatives | |||
Carnoy's (Farmer's) fixative | Absolute ethanol : glacial acetic acid, 3:1 (ml:ml) | ||
Methanol/acetic acid fixative | 50 % (v/v) methanol, 10 % (v/v) glacial acetic acid in deionized water | ||
FPA50 fixative | Formalin, propionic acid, 50% ethanol; 5:5:90 (ml:ml:ml) | ||
Clearing solutions | |||
Chloral hydrate/glycerol | Chloral hydrate : glycerol : water, 8:1:2 (g:ml:ml). Can be used for all flower developmental stages and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50 | ||
Modified Hoyer | Gum arabic 7.5 g, chloral hydrate 100 g, glycerol 5 ml , water 30 ml. Can be used for all flower developmental stages and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50 | ||
Herr's 4½ clearing fluid | Lactic acid, chloral hydrate, phenol crystals, clove oil, xylene; 2:2:2:2:1, by weight. Can be used for all flower developmental stages (especially for stamen development) and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50 | ||
SDS/NaOH solution | Mix-dilute the the SDS and the NaOH stock solution to 1% SDS / 0.2 N NaOH (10x dilution). For all stages of flower and silique developmental stages. The best fixative is the methano/acetic acid fixative; the other two fixatives can also be used. Can be combined with calcofluor, auramine, DAPI, and aniline blue staining solution. | ||
SDS stock solution | 10 % (w/v) sodium dodecyl sulphate. Dissolve 10 g sodium dodecyl sulphate in 80 ml deionized water and make up to 100 ml with deionized water. | ||
NaOH stock solution | 2 N NaOH solution: dissolve 4 g of NaOH in 40 ml of deionized water and make up to 100 ml with deionized water | ||
Combined clearing and staining solutions | |||
Herr's IKI-4½ | To a standard 4½ (9 g in total) add: 100 mg iodine, 500 mg potassium iodide. This clearing solution can be used for all flower developmental stages and for silique development, either for increasing contrast or for characterizing starch dynamics. Use FPA50 for structural analysis and Carnoy's fixative for quantitative starch analysis. | ||
Alexander staining | Ethanol 95% 10ml, malachite green (1% in 95% EtOH) 1 ml, fuchsin acid (1% in ddH2O) 5ml, orange G (1% in ddH2O) 0.5ml, phenol 5g, chloral hydrate 5g, glacial acetic acid 2ml, glycerol 25ml . This clearing/staining alone or in combination with Herr's 4½ solution can be used to evaluate pollen abortion in flowers with mature and tricellular pollen grains. It's used on freshly harved non-fixed material. | ||
Staining solutions | |||
Calcofluor solution | Calcofluor 0.007% in water (g:ml). Originally used as an optical brightner. Can be used for staining cellulose, carboxylated polysaccharides and callose in cell walls. Frequently used to stain the intine of the pollen grain. All three fixatives can be used with this solution. | ||
Auramine solution | Auramine 0.01% in water (g:ml). This lipophilic fluorscent dye can be used for staining cuticles, cutin, and exine among others. All three fixatives can be used with this solution | ||
Calcofluor-Auramine mixture | Auramine solution : Calcofluor solution, 3:1. Can be used for a combined staining by both solutions. Other proportions can be assayed maintaining a smaller proportion of calcofluor with respect to auramine. | ||
DAPI solution | DAPI 0.4 ug/ml, 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 7), 0.1% Triton-X-100, 1 mM EDTA. This solution can be used for staining chromosome spreads during male and female meiosis, and cell nuclei of any tissue. Frequently used for studying pollen grain development. Carnoy's and methanol/ acetic acid are the best fixatives for this solution. Formaldehyde-based fixatives such as FPA50 may interfere with the staining. Excitation in the UV and maximum emission around 461 nm. | ||
Sodium phosphate buffer (0.1 M) | Proton receptor: 0.2 M Na2HPO4, proton donor: 0.2 M NaH2PO4, ratio proton donor / proton receptor: 1.364 ( for a pH 7) | ||
Aniline blue solution | 0.1% (w/v) aniline blue, 108 mM K3PO4 (pH 11), 2% glycerol. This solution can be used for staining callose and cellulose of many stages of development (e.g callose deposition in male and female terads, callose plugs in pollen tubes). Excitation in the UV and maximum emission around 455. It can also be excited at 514 nm with emission in the red for cell content staining. |