مركز الجامعة-جبل وتلطيخ نبات زهرة الأجهزة وسيليكويس
Summary
في هذا البروتوكول، نحن تصف التقنيات لتشريح سليم من نبات الزهور وسيليكويس، بعض تقنيات مسح الأساسية، وتحديد تلطيخ إجراءات الملاحظات جبل كل الهياكل الإنجابية.
Abstract
سبب أدواته الهائلة للدراسات الوراثية الجزيئية، أعطيت التمويل واحدة من أبرز الأنواع النموذجية في علم الأحياء النباتية، وخاصة في مصنع بيولوجيا التناسل. إلا أن المصنع مورفولوجية، تشريحية، وتحليلات ultrastructural تقليديا تنطوي التضمين مضيعة للوقت وتمزيقها الإجراءات الميدانية مشرق والمسح الضوئي والميكروسكوب الإلكتروني. التقدم الذي أحرز مؤخرا في الأسفار [كنفوكل] مجهرية وتحليلات مجهرية الدولة من الفن ثلاثي الأبعاد للحاسوب والتحسين المتواصل للتقنيات الجزيئية لاستخدامها على الحد الأدنى من المعالجة جبل كل العينات، قد أدى إلى زيادة طلب على تطوير تقنيات معالجة عينة تتسم بالكفاءة والحد الأدنى. في هذا البروتوكول، يمكننا وصف تقنيات بشكل صحيح تشريح نبات الزهور وسيليكويس، الأساسية تبادل التقنيات، وبعض إجراءات المصبوغة للجامعة-جبل الملاحظات لهياكل الإنجابية.
Introduction
الزهور هي من بين أهم تعريف الأجهزة من كاسيات البذور. النباتات المزهرة ظهرت قبل حوالي 90 مليون سنة1، وتنوعاً بسرعة أن مظهرها السريع وصفت بأنها “لغزا بغيضة” تشارلز داروين2. وتتنوع مصالح الباحثين المصنع في تنمية الزهور. بعض البحوث قد ركزت على فهم أصل تطوري الزهرة ككل، أو تطور الخصائص التشريحية وهيكلية ووظيفية محددة من الزهور3،،من45،6 . التباين العالي في شكل الأزهار والهيكل، فضلا عن طرق التكاثر الجنسي والتكاثر اللاجنسي الاعتماد عليها، جعل الزهرة بنية معقدة للغاية. وقد أدى هذا إلى جهود متنوعة لوصف السمات الهيكلية والتشريح أجهزة الأزهار، واستخدام تقنيات تقنيين الإلكترون والضوء التي يمكن أن تكون جنبا إلى جنب مع التحقيقات الجينية والجزيئية7. وعلاوة على ذلك، كمصدر للفواكه والبذور والزهور من الأهمية بالنسبة للتغذية البشرية والحيوانية. ولذلك، وصف وضع الزهور والفواكه آثار العديد من البحوث التطبيقية، بما في ذلك الأمن الغذائي سكان بشرية المتزايدة واستراتيجيات الحفاظ على البيئة في إطار بيئة متغيرة8 , 9 , 10.
التنمية الزهرة في نبات يبدأ التعريفي زهرة وتحويل أرض الخضري إلى أرض نورات (مجموعة من الزهور). وتبدأ بريمورديا زهرة جانبياً في الجناح من أرض نورات11. بريمورديا جهاز الأزهار تشكل تدريجيا في جدلات متحدة المركز من الخارج إلى مركز الزهرة، وتتحول في نهاية المطاف إلى كاسية، تلات، والاسدية، وكاربيلس7. هذه الأجهزة الأزهار تحقيق الحماية التغذوية، متميزة، والوظيفية (مثلاً، جذب الملقحات) أدوار في الأنواع النباتية المختلفة، مع الأعضاء الجنسية استدامة تنمية جاميتوفيتيس الذكور والإناث، على التوالي12 , 13. جاميتوفيتيس، بدوره، تميز كل زوج من الذكور (الحيوانات المنوية) والإناث الجاميطات (البويضة والخلية المركزية)، التي توحد عند ضعف الإخصاب لتشكيل الجيل القادم واقحه والسويداء الأولية، دعم الأنسجة الطرفية التنمية الجنين14،15. تطوير الفواكه والبذور دعم نمو ونضج، والمحافظة على الجنين، وفي نهاية المطاف، التشتت. وقد أجريت بحوث مستفيضة لتوصيف وضع الزهور والجنين في الأنواع النباتية المتنوعة، لا سيما في الأنواع النموذجية التي أعطيت7،،من1617.
استندت تحليلات مجهرية المبكر للتنمية زهرة تجهيز العينة مضيعة للوقت ومراقبة تقنيات مثل البارافين أو الراتنج التضمين وتمزيقها، جنبا إلى جنب مع الضوء أو المجهر الإلكتروني. وكثيراً ما استخدمت هذه التقنيات المجهرية التقليدية في تركيبة مع التحقيقات الجينية الجزيئية، مثل تحليلات تقنيين من طفرات، وإضفاء الطابع المحلي على الجيش الملكي النيبالي بالتهجين في الموقع ، أو المناعية-الكشف عن البروتينات. وادي التقدم الذي أحرز مؤخرا في الفحص المجهري الأسفار واسع المجال و [كنفوكل]، في تحليلات للدولة من أحدث صورة الحاسوب ثلاثي الأبعاد، والتحسين المتواصل للأساليب الجزيئية التي يمكن استخدامها في معالجة الحد الأدنى الجامع-جبل العينات، بحاجة إلى نموذج الكفاءة والحد الأدنى من تقنيات المعالجة قابلة تفضيلي للتحليلات الكمية. في السنوات الأخيرة، أحرز تقدم كبير في تطوير تقنيات مسح على عينة حيوانية الجامعة-جبل. أنها تجعل العينة شفافة أما باستخدام الكواشف المستندة اليوريا أو السكر مائي (مثلاً، مقياس، سيدب، مكعب)18،،من1920، أو بشكل انتقائي إزالة الدهون (باستخدام مواد التنظيف الحزب الديمقراطي الصربي) بعد تضمين عينات في الهلاميات المائية مستقرة؛ إزالة الدهون يمكن تحقيقه أما عن طريق نشر السلبي (مثلاً، تعديل الوضوح البروتوكول21،22من الميثاق-بارس-دواليب) أو بنشاط بالتفريد (الأصلي الوضوح البروتوكول23 و24من قانون-المعزوفة). وبتشجيع من هذا التقدم السريع، ظهرت بعض التقنيات المشتقة أيضا للاستخدام في المصانع.
في هذه الورقة أساليب تركز على نموذج نبات، يصف لنا إجراء تشريح سليم براعم الزهور، والزهور، وسيليكويس الشباب، وتطهير الجامعة-جبل عينات لتلطيخ المتنوعة وإجراءات المراقبة باستخدام الكلاسيكية أو أسلوب تطهير القائم على الحزب الديمقراطي الصربي مؤخرا. وترد أمثلة للنشا، كلوس، وتلطيخ الكروماتين. على الرغم من أن قد تحتاج هذه الإجراءات إلى مزيد من التحسينات والتعديلات المدخلة عند استخدامها مع الأنواع الأخرى، ونأمل أنهم سوف يمهد لإجراء المزيد من البحوث حول هذه الأساليب بسيطة ولكن الهامة التي هي نقطة انطلاق للعديد من مشاريع البحوث.
Protocol
Representative Results
Discussion
وجود العديد من براعم الزهور داخل نورات واحدة من نبات، التي تغطي جميع مراحل نمو الزهرة، يوفر فرصة فريدة من نوعها لدراسات تهدف إلى وصف تأثير علاج أو ميزة الإنمائية في الوقت نفسه عبر مراحل مختلفة من التنمية زهرة. نقطة مرجعية جيدة بين مختلف النباتات الفردية هو افتتاح أول زهرة نورات الرئي?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
هذا العمل كان تدعمها جامعة زيوريخ، على الانبعاث ماري كوري منحة (منح لا. TransEpigen-254797 إلى هجري)، “منحة متقدمة” “مجلس البحوث الأوروبي” (منحة لا. MEDEA-250358 بعنوان)، ومشروع بحوث وتطوير التكنولوجيا (منح مكان لعنوان) من SystemsX.ch، “المبادرة السويسرية” في “بيولوجيا الأنظمة”.
Materials
| Reagents and Materials | |||
| Ethanol | Scharlau | ET00102500 | |
| Acetic Acid | Applichem | A3686,2500 | 100% Molecular biology grade |
| Glacial Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 320099 | Molecular Biology Grade |
| Methanol | Scharlau | ME03062500 | |
| Formaldehyde Solution | Sigma-Aldrich | F1635 | |
| Propionic acid | Sigma-Aldrich | 81910-250 ml | |
| Chloral hydrate | Sigma-Aldrich | 15307 | |
| Glycerol | Roth | 3783.1 | |
| Gum arabic | Fluka | 51198 | |
| Lactic acid | Fluka | 69773 | |
| Phenol | Sigma-Aldrich | 77607-250ML | We used liquid phenol (use the density to find the required volume for your solution) |
| Clove oil | Sigma-Aldrich | C8392-100ML | |
| Xylene | Roth | 4436.1 | |
| Iodine | Fluka | 57665 | |
| Potassium iodide | Merck | 5043 | |
| Malachite Green | Fluka | 63160 | |
| Fuchsin acid | Fluka | 84600 | |
| Orange G | Sigma | 7252 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | Molecular Biology Grade |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 71690 | |
| Sodium di-Hydrogen Phosphate | Applichem | A1047,1000 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S9763-1KG | |
| Potassium phosphate | Sigma-Aldrich | 04347 | |
| EDTA | Applichem | A2937,1000 | |
| Calcofluor | Sigma | F6259 | Fluorescent brightener 28 |
| Auramine | Chroma | 10120 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | toxic |
| Triton-X-100 | Sigma | T8787 | |
| Aniline blue | Merck | 1275 | |
| MS medium | Carolina | 19-57030 | |
| Nutrient-rich substrate | Einheitserde | ED73 | |
| Watch maker's glass | No specific brand | ||
| 15 ml falcon centrifuge tubes | VWR | 62406-200 | |
| Dumond Forceps | Actimed | 0208-5SPSF-PS | |
| Forceps | DUMONT BIOLOGY | 0108-5 | |
| Syringe | BD | BD Plastipak 300013 | 1 ml |
| Preparation needle | BD | BD Microlance 304000 | |
| Microscope slides | Thermo Scientific | 10143562CE | cut edges |
| Coverslips | Thermo Scientific | DV40008 | |
| Humid box | A plastic box with damp paper towel and slide supports inside | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions | |||
| Fixatives | |||
| Carnoy's (Farmer's) fixative | Absolute ethanol : glacial acetic acid, 3:1 (ml:ml) | ||
| Methanol/acetic acid fixative | 50 % (v/v) methanol, 10 % (v/v) glacial acetic acid in deionized water | ||
| FPA50 fixative | Formalin, propionic acid, 50% ethanol; 5:5:90 (ml:ml:ml) | ||
| Clearing solutions | |||
| Chloral hydrate/glycerol | Chloral hydrate : glycerol : water, 8:1:2 (g:ml:ml). Can be used for all flower developmental stages and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50 | ||
| Modified Hoyer | Gum arabic 7.5 g, chloral hydrate 100 g, glycerol 5 ml , water 30 ml. Can be used for all flower developmental stages and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50 | ||
| Herr's 4½ clearing fluid | Lactic acid, chloral hydrate, phenol crystals, clove oil, xylene; 2:2:2:2:1, by weight. Can be used for all flower developmental stages (especially for stamen development) and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50 | ||
| SDS/NaOH solution | Mix-dilute the the SDS and the NaOH stock solution to 1% SDS / 0.2 N NaOH (10x dilution). For all stages of flower and silique developmental stages. The best fixative is the methano/acetic acid fixative; the other two fixatives can also be used. Can be combined with calcofluor, auramine, DAPI, and aniline blue staining solution. | ||
| SDS stock solution | 10 % (w/v) sodium dodecyl sulphate. Dissolve 10 g sodium dodecyl sulphate in 80 ml deionized water and make up to 100 ml with deionized water. | ||
| NaOH stock solution | 2 N NaOH solution: dissolve 4 g of NaOH in 40 ml of deionized water and make up to 100 ml with deionized water | ||
| Combined clearing and staining solutions | |||
| Herr's IKI-4½ | To a standard 4½ (9 g in total) add: 100 mg iodine, 500 mg potassium iodide. This clearing solution can be used for all flower developmental stages and for silique development, either for increasing contrast or for characterizing starch dynamics. Use FPA50 for structural analysis and Carnoy's fixative for quantitative starch analysis. | ||
| Alexander staining | Ethanol 95% 10ml, malachite green (1% in 95% EtOH) 1 ml, fuchsin acid (1% in ddH2O) 5ml, orange G (1% in ddH2O) 0.5ml, phenol 5g, chloral hydrate 5g, glacial acetic acid 2ml, glycerol 25ml . This clearing/staining alone or in combination with Herr's 4½ solution can be used to evaluate pollen abortion in flowers with mature and tricellular pollen grains. It's used on freshly harved non-fixed material. | ||
| Staining solutions | |||
| Calcofluor solution | Calcofluor 0.007% in water (g:ml). Originally used as an optical brightner. Can be used for staining cellulose, carboxylated polysaccharides and callose in cell walls. Frequently used to stain the intine of the pollen grain. All three fixatives can be used with this solution. | ||
| Auramine solution | Auramine 0.01% in water (g:ml). This lipophilic fluorscent dye can be used for staining cuticles, cutin, and exine among others. All three fixatives can be used with this solution | ||
| Calcofluor-Auramine mixture | Auramine solution : Calcofluor solution, 3:1. Can be used for a combined staining by both solutions. Other proportions can be assayed maintaining a smaller proportion of calcofluor with respect to auramine. | ||
| DAPI solution | DAPI 0.4 ug/ml, 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 7), 0.1% Triton-X-100, 1 mM EDTA. This solution can be used for staining chromosome spreads during male and female meiosis, and cell nuclei of any tissue. Frequently used for studying pollen grain development. Carnoy's and methanol/ acetic acid are the best fixatives for this solution. Formaldehyde-based fixatives such as FPA50 may interfere with the staining. Excitation in the UV and maximum emission around 461 nm. | ||
| Sodium phosphate buffer (0.1 M) | Proton receptor: 0.2 M Na2HPO4, proton donor: 0.2 M NaH2PO4, ratio proton donor / proton receptor: 1.364 ( for a pH 7) | ||
| Aniline blue solution | 0.1% (w/v) aniline blue, 108 mM K3PO4 (pH 11), 2% glycerol. This solution can be used for staining callose and cellulose of many stages of development (e.g callose deposition in male and female terads, callose plugs in pollen tubes). Excitation in the UV and maximum emission around 455. It can also be excited at 514 nm with emission in the red for cell content staining. |
References
- Crane, P. R., Friis, E. M., Pedersen, K. R. The origin and early diversification of angiosperms. Nature. 374 (6517), 27-33 (1995).
- Friedman, W. E. The meaning of Darwin’s ‘abominable mystery’. Am J Bot. 96 (1), 5-21 (2009).
- Sun, G., Dilcher, D. L., Zheng, S., Zhou, Z. In search of the first flower: A Jurassic angiosperm, Archaefructus, from Northeast China. Science. 282 (5394), 1692-1695 (1998).
- Mulcahy, D. L. The rise of the angiosperms: a genecological factor. Science. 206 (4414), 20-23 (1979).
- Friedman, W. E., Moore, R. C., Purugganan, M. D. The evolution of plant development. Am J Bot. 91 (10), 1726-1741 (2004).
- Endress, P. K., Soltis, D., Soltis, P., Leebens-Mack, J. Angiosperm floral evolution: morphological developmental framework. Advances in botanical research Volume 44: Developmental genetics of the flower. , 1-61 (2006).
- Alvarez-Buylla, E. R., et al. Flower development. Arabidopsis Book. 8, 30127 (2010).
- Beddington, J. Food security: contributions from science to a new and greener revolution. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 365 (1537), 61-71 (2010).
- Godfray, H. C., et al. Food security: The challenge of feeding 9 billion people. Science. 327 (5967), 812-818 (2010).
- Burkle, L. A., Alarcón, R. The future of plant-pollinator diversity: understanding interaction networks across time, space, and global change. Am J Bot. 98 (3), 528-538 (2011).
- Meyerowitz, E. M., et al. A genetic and molecular model for flower development in Arabidopsis thaliana. Dev Suppl. 1, 157-167 (1991).
- Hafidh, S., Fíla, J., Honys, D. Male gametophyte development and function in angiosperms: a general concept. Plant Reprod. 29 (1-2), 31-51 (2016).
- Schmidt, A., Schmid, M. W., Grossniklaus, U. Plant germline formation: common concepts and developmental flexibility in sexual and asexual reproduction. Development. 142 (2), 229-241 (2015).
- Sprunck, S., Dresselhaus, T. Three cell fusions during double fertilization. Cell. 161 (4), 708-709 (2015).
- Dresselhaus, T., Sprunck, S., Wessel, G. M. Fertilization mechanisms in flowering plants. Curr Biol. 26 (3), R125-R139 (2016).
- Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M. Early flower development in Arabidopsis. Plant Cell. 2 (8), 755-767 (1990).
- Roeder, A. H., Yanofsky, M. F. Fruit development in Arabidopsis. Arabidopsis Book. 4, e0075 (2006).
- Hama, H., et al. Scale, a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat Neurosci. 14 (11), 1481-1488 (2011).
- Ke, M. -. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB. a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nat Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
- Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nat Methods. 10 (6), 508-513 (2013).
- Lee, E., et al. ACT-PRESTO: rapid and consistent tissue clearing and labeling method for 3-dimensional (3D) imaging. Sci Rep. 6, 18631 (2016).
- Endress, P. K. Evolution and floral diversity: the phylogenetic surroundings of Arabidopsis and Antirrhinum. Int J Plant Sci. 153 (3, Part 2), S106-S122 (1992).
- Reyes-Olalde, J. I., Zuñiga-Mayo, V. M., Chávez Montes, R. A., Marsch-Martínez, N., de Folter, S. Inside the gynoecium: at the carpel margin. Trends Plant Sci. 18 (11), 644-655 (2013).
- Hill, J. P., Lord, E. M. Floral development in Arabidopsis thaliana: a comparison of the wild type and the homeotic pistillata mutant. Can J Bot. 67 (10), 2922-2936 (1989).
- Sessions, R. A., Zambryski, P. C. Arabidopsis gynoecium structure in the wild type and in ettin mutants. Development. 121 (5), 1519-1532 (1995).
- Schneitz, K., Hülskamp, M., Pruitt, R. E. Wild-type ovule development in Arabidopsis thaliana: a light microscope study of cleared whole-mount tissue. Plant J. 7 (5), 731-749 (1995).
- Sundberg, E., Ferrándiz, C., Østergaard, L. Gynoecium patterning in Arabidopsis: a basic plan behind a complex structure. Annual Plant Reviews Volume 38: Fruit Development and Seed Dispersal. , 35-69 (2009).
- Meinke, D. W. 10 seed development in Arabidopsis thaliana. Cold Spring Harbor Monograph Archive. 27, 253-295 (1994).
- Weigel, D., Glazebrook, J. . Arabidopsis: a laboratory manual. , (2002).
- Herr, J. M. A new clearing-squash technique for the study of ovule development in angiosperms. Am J Bot. 58 (8), 785-790 (1971).
- Alexander, M. P. A versatile stain for pollen fungi, yeast and bacteria. Stain Technol. 55 (1), 13-18 (1980).
- Herr, J. M. Applications of a new clearing technique for the investigation of vascular plant morphology. J Elisha Mitchell Sci Soc Chapel Hill N C. 88 (3), 137-143 (1972).
- Herr, J. M., Goldman, C. A., Hauta, P. L., O’Donnell, M. A., Andrews, S. E., van der Heiden, R. Clearing techniques for the study of vascular plant tissues in whole structures and thick sections. Tested studies for laboratory teaching. Proceedings of the Fifth Workshop/Conference of the Association for Biology Laboratory Education (ABLE). 5, 63-84 (1993).
- Colcombet, J., Boisson-Dernier, A., Ros-Palau, R., Vera, C. E., Schroeder, J. I. Arabidopsis somatic embryogenesis receptor kinases1 and 2 are essential for tapetum development and microspore maturation. Plant Cell. 17 (12), 3350-3361 (2005).
- Heslop-Harrison, J., Heslop-Harrison, Y., Shivanna, K. R. The evaluation of pollen quality and a further appraisal of the fluorochromatic (FCR) test procedure. Theor Appl Genet. 67 (4), 367-379 (1984).
- Stone, J. L., Thomson, J. D., Dent-Acosta, S. J. Assessment of pollen viability in handpollination experiments: A review. Amer J Bot. 82 (9), 1186-1197 (1995).
- Dafni, A., Firmage, D. Pollen viability and longevity: practical, ecological and evolutionary implications. Plant Syst Evol. 222 (1-4), 113-132 (2000).
- Lora, J., Testillano, P. S., Risueño, M. C., Hormaza, J. I., Herrero, M. Pollen development in Annona cherimola Mill. (Annonaceae). Implications for the evolution of aggregated pollen. BMC Plant Biol. 9, 129 (2009).
- Ross, K. J., Fransz, P., Jones, G. H. A light microscopic atlas of meiosis in Arabidopsis thaliana. Chromosome Res. 4 (7), 507-516 (1996).
- Park, S. K., Howden, R., Twell, D. The Arabidopsis thaliana gametophytic mutation gemini pollen1 disrupts microspore polarity, division asymmetry and pollen cell fate. Development. 125 (19), 3789-3799 (1998).
- Haseloff, J. Old botanical techniques for new microscopes. BioTechniques. 34 (6), 1174-1182 (2003).
- Truernit, E., et al. High-resolution whole-mount imaging of three-dimensional tissue organization and gene expression enables the study of phloem development and structure in Arabidopsis. Plant Cell. 20 (6), 1494-1503 (2008).
- Hedhly, A., et al. Starch turnover and metabolism during flower and early embryo development. Plant Physiol. 172 (4), 2388-2402 (2016).
- Crane, C. F., Carman, J. G. Mechanisms of apomixis in Elymus rectisetus from eastern Australia and New Zealand. Am J Bot. 74 (4), 477-496 (1987).
- Young, B. A., Sherwood, R. T., Bashaw, E. C. Cleared-pistil and thick-sectioning techniques for detecting aposporous apomixis in grasses. Can J Bot. 57 (15), 1668-1672 (1979).
- Kurihara, D., Mizuta, Y., Sato, Y., Higashiyama, T. ClearSee: a rapid optical clearing reagent for whole-plant fluorescence imaging. Development. 142, 4168-4179 (2015).
- Warner, C. A., et al. An optical clearing technique for plant tissues allowing deep imaging and compatible with Fluorescence Microscopy. Plant Phys. 166, 1684-1687 (2014).
- Hasegawa, J., Sakamoto, Y., Nakagami, S., Aida, M., Sawa, S., Matsunaga, S. Three-dimensional imaging of plant organs using a simple and rapid transparency technique. Plant Cell Physiol. 57 (3), 462-472 (2016).
- Musielak, T. J., Slane, D., Liebig, C., Bayer, M. A Versatile Optical Clearing Protocol for Deep Tissue Imaging of Fluorescent Proteins in Arabidopsis thaliana. PLoS ONE. 11 (8), e0161107 (2016).
