כולה-הר ניקוי, כתמים של תודרנית פרח איברים, Siliques
Summary
ב פרוטוקול זה, אנחנו מתארים טכניקות ניתוח ראוי תודרנית פרחים, siliques, כמה טכניקות ניקוי בסיסי, ונבחר מכתים נהלי כולה-הר תצפיות מבני הרבייה.
Abstract
בשל כלי אימתני שלו ללימודי הגנטי המולקולרי, תודרנית לבנה הוא אחד המינים דגם הבולטים ביותר בביולוגיה צמח, במיוחד, צמח הרבייה הביולוגית. עם זאת, צמח מורפולוגי, אנטומי, וניתוחים ultrastructural באופן מסורתי כוללים גוזלת זמן הטמעה חלוקתה הליכים שדה בהיר, סריקה של מיקרוסקופ אלקטרונים. התקדמות אחרונים במיקרוסקופ קונפוקלי פלורסצנטיות, המדינה-of-the-art תלת-ממדי בעזרת מחשב מיקרוסקופיים ניתוחים ו עידון רציפה של טכניקות מולקולריות כדי לשמש על דגימות כולה-הר מינימלית מעובד, הוביל לביקוש מוגבר פיתוח טכניקות עיבוד מדגם מינימלי ויעילה. פרוטוקול זה, אנו מתארים שיטות ניקוד כראוי תודרנית ופרחים, בסיסי ניקוי טכניקות, siliques, כמה הליכים מכתימים עבור כולה-הר תצפיות מבני הרבייה.
Introduction
פרחים בין החשובים ביותר מגדיר את האיברים של angiosperms. צמחים פורחים הופיע לפני כמה שנים 90-130 מיליון1, ואת המגוון כל כך מהר כי הופעתם מהירה תוארה “תעלומה הזוועה” מאת צ’רלס דרווין2. האינטרסים של חוקרי הצמחים בהתפתחות פרחים מגוונים. מחקר התמקדה הבנת המקור האבולוציוני של הפרח כולו, או את האבולוציה של תכונות אנטומיות מבניות, פונקציונלי ספציפי של פרחים3,4,5,6 . וריאציית גבוהה ב טופס פרחוני, מבנה, כמו גם את דרכי רבייה אל-זוויגית ופוגע להסתמך עליהם, להפוך הפרח מבנה מורכב מאוד. זה הוביל במאמצים מגוונים לאפיון התכונות אנטומיה מבניים איברים פרחוני, תוך שימוש בטכניקות microscopical אלקטרון ואור זה יכול להיות משולב עם חקירות גנטית ומולקולרית7. יתרה מזאת, כמקור של פירות וזרעים, פרחים הם בחשיבות עליונה על תזונת האדם ושל בעלי החיים. לכן, אפיון ופיתוח פרחים ופירות יש השלכות רבות על מחקר יישומי, כולל מזון אבטחה עבור אוכלוסיה אנושית וגובר ואסטרטגיות שימור אקולוגי תחת סביבה משתנה8 , 9 , 10.
פיתוח פרח תודרנית מתחיל עם פרח אינדוקציה, הטרנספורמציה של meristem וגטטיבי כדי meristem תפרחת (קבוצה של פרחים). פרח primordia מבוצעים רוחבית לאגף מ meristem תפרחת11. Primordia איברים פרחוני בהדרגה בצורה המעגלים הקונצנטריים מבחוץ אל מרכז הפרח, ובסופו של דבר לפתח לתוך עלי גביע, עלי כותרת, אבקנים, carpels7. אלו איברים פרחוני להגשים הגנתי התזונתי, ברורים, ואת פונקציונלי (למשל, המשיכה המאביק) תפקידי מיני צמחים שונים, עם איברי המין סופגת את התפתחות gametophytes זכר ונקבה, בהתאמה12 , 13. gametophytes, בתורו, להבדיל כל זוג של זכר (זרע) ולהכפיל גמטות הנשי (ביצה, תא מרכזי), אשר התאחדו על הפריה כדי ליצור את הדור הבא של הזיגוטה, את האנדוספרם העיקרי, רקמות מסוף המשנה התפתחות העובר ה-14,15. פיתוח זרעים ופירות תומכת צמיחה, התבגרות, שימור העובר ופיזור, בסופו של דבר, שלה. מחקר מקיף בוצעה כדי לאפיין את הפרחים והתפתחות העובר במיני צמחים שונים, במיוחד במינים דגם תודרנית7,16,17.
ניתוחים מיקרוסקופיים מוקדם של התפתחות פרחים היו מבוססים על מדגם גוזלת זמן עיבוד והתבוננות טכניקות, כמו פרפין או שרף הטבעה ו חלוקתה, בשילוב עם אור או מיקרוסקופ אלקטרונים. טכניקות אלה מיקרוסקופיים מסורתי שימשו לעיתים קרובות בשילוב עם חקירות הגנטי המולקולרי, כגון ניתוחים microscopical של מוטציות, הלוקליזציה של RNA על ידי הכלאה בחיי עיר או חיסונית-זיהוי חלבונים. התקדמות אחרונים במיקרוסקופ שדה רחב וקונפוקלי פלורסצנטיות, התמונה בעזרת מחשב תלת-ממדי המדינה-of-the-art ניתוחים, עידון רציפה של שיטות מולקולריות שניתן להשתמש בהם על דגימות כולה-הר מינימלית מעובד, הוביל צורך טכניקות עיבוד מינימלי ויעילה מדגם נתונות מעדיפים כמותני. בשנים האחרונות הפך התקדמות משמעותית בפיתוח טכניקות ניקוי על הדגימה בעלי חיים שלמים-הר. הם לעיבוד המדגם שקוף באמצעות מימית אוריאה – או סוכר מבוססי ריאגנטים (למשל, קנה מידה, SeeDB, מעוקב)18,19,20, או על ידי באופן סלקטיבי הסרת שומנים (באמצעות הנוזל מרחביות) לאחר הטבעה דגימות ב hydrogels יציב; הסרת שומנים יכולה להיות מושגת באמצעות דיפוזיה פסיבית (שונה,למשלפרוטוקול בהירות21, ברית-PARS-חישוקים22) או באופן פעיל על-ידי אלקטרופורזה (בהירות המקורי פרוטוקול23 ו מעשה-פרסטו24). בעידודה של התקדמות מהירה זו, כמה טכניקות נגזר גם מתגלים לשימוש בצמחים.
בנייר זה שיטות התמקדו המודל תודרנית, נתאר ההליך את הקרע הנכון של ניצני פרחים, פרחים, siliques צעיר, קרחת היער של דגימות כולה-הר עבור צביעת מגוונות ונהלים התבוננות באמצעות קלאסית או שיטה סליקה מבוססי מרחביות האחרונות. דוגמאות עמילן, callose של כרומטין מכתים ניתנת. אף על פי נהלים אלה עליך בהמשך שיפורים והתאמות בעת שימוש עם מינים אחרים, אנו מקווים שהם יהיה להגדיר את הבמה עבור מחקר נוסף על שיטות אלה פשוט אבל קריטיים המהווים נקודת ההתחלה של פרויקטי מחקר רבים.
Protocol
Representative Results
Discussion
קיומו של ניצני פרחים רבים בתוך תפרחת בודדת של תודרנית, המתפרסות על-פני כל שלבים התפתחותיים של פרח, מציע הזדמנות ייחודית ללימודי מכוון אפיון אפקט של טיפול או תכונה התפתחותית בו זמנית על פני בשלבים שונים של פיתוח פרח. נקודת התייחסות טובה בין מיני צמחים בודדים הוא פתיחת הפרח הראשון של הת?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי אוניברסיטת ציריך, הפורום הישראלי לאנרגיה מארי קירי גרנט (מענק. לא. TransEpigen-254797 אל A.H.), גרנט מתקדם של המועצה האירופית למחקר (מענק. לא. MEDEA-250358 אל U.G.), ומחקר ופיתוח טכנולוגיה פרוייקט (גרנט MecanX כדי U.G.) מ- SystemsX.ch, היוזמה שוויצרי במערכות ביולוגיות.
Materials
| Reagents and Materials | |||
| Ethanol | Scharlau | ET00102500 | |
| Acetic Acid | Applichem | A3686,2500 | 100% Molecular biology grade |
| Glacial Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 320099 | Molecular Biology Grade |
| Methanol | Scharlau | ME03062500 | |
| Formaldehyde Solution | Sigma-Aldrich | F1635 | |
| Propionic acid | Sigma-Aldrich | 81910-250 ml | |
| Chloral hydrate | Sigma-Aldrich | 15307 | |
| Glycerol | Roth | 3783.1 | |
| Gum arabic | Fluka | 51198 | |
| Lactic acid | Fluka | 69773 | |
| Phenol | Sigma-Aldrich | 77607-250ML | We used liquid phenol (use the density to find the required volume for your solution) |
| Clove oil | Sigma-Aldrich | C8392-100ML | |
| Xylene | Roth | 4436.1 | |
| Iodine | Fluka | 57665 | |
| Potassium iodide | Merck | 5043 | |
| Malachite Green | Fluka | 63160 | |
| Fuchsin acid | Fluka | 84600 | |
| Orange G | Sigma | 7252 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | Molecular Biology Grade |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 71690 | |
| Sodium di-Hydrogen Phosphate | Applichem | A1047,1000 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S9763-1KG | |
| Potassium phosphate | Sigma-Aldrich | 04347 | |
| EDTA | Applichem | A2937,1000 | |
| Calcofluor | Sigma | F6259 | Fluorescent brightener 28 |
| Auramine | Chroma | 10120 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | toxic |
| Triton-X-100 | Sigma | T8787 | |
| Aniline blue | Merck | 1275 | |
| MS medium | Carolina | 19-57030 | |
| Nutrient-rich substrate | Einheitserde | ED73 | |
| Watch maker's glass | No specific brand | ||
| 15 ml falcon centrifuge tubes | VWR | 62406-200 | |
| Dumond Forceps | Actimed | 0208-5SPSF-PS | |
| Forceps | DUMONT BIOLOGY | 0108-5 | |
| Syringe | BD | BD Plastipak 300013 | 1 ml |
| Preparation needle | BD | BD Microlance 304000 | |
| Microscope slides | Thermo Scientific | 10143562CE | cut edges |
| Coverslips | Thermo Scientific | DV40008 | |
| Humid box | A plastic box with damp paper towel and slide supports inside | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions | |||
| Fixatives | |||
| Carnoy's (Farmer's) fixative | Absolute ethanol : glacial acetic acid, 3:1 (ml:ml) | ||
| Methanol/acetic acid fixative | 50 % (v/v) methanol, 10 % (v/v) glacial acetic acid in deionized water | ||
| FPA50 fixative | Formalin, propionic acid, 50% ethanol; 5:5:90 (ml:ml:ml) | ||
| Clearing solutions | |||
| Chloral hydrate/glycerol | Chloral hydrate : glycerol : water, 8:1:2 (g:ml:ml). Can be used for all flower developmental stages and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50 | ||
| Modified Hoyer | Gum arabic 7.5 g, chloral hydrate 100 g, glycerol 5 ml , water 30 ml. Can be used for all flower developmental stages and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50 | ||
| Herr's 4½ clearing fluid | Lactic acid, chloral hydrate, phenol crystals, clove oil, xylene; 2:2:2:2:1, by weight. Can be used for all flower developmental stages (especially for stamen development) and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50 | ||
| SDS/NaOH solution | Mix-dilute the the SDS and the NaOH stock solution to 1% SDS / 0.2 N NaOH (10x dilution). For all stages of flower and silique developmental stages. The best fixative is the methano/acetic acid fixative; the other two fixatives can also be used. Can be combined with calcofluor, auramine, DAPI, and aniline blue staining solution. | ||
| SDS stock solution | 10 % (w/v) sodium dodecyl sulphate. Dissolve 10 g sodium dodecyl sulphate in 80 ml deionized water and make up to 100 ml with deionized water. | ||
| NaOH stock solution | 2 N NaOH solution: dissolve 4 g of NaOH in 40 ml of deionized water and make up to 100 ml with deionized water | ||
| Combined clearing and staining solutions | |||
| Herr's IKI-4½ | To a standard 4½ (9 g in total) add: 100 mg iodine, 500 mg potassium iodide. This clearing solution can be used for all flower developmental stages and for silique development, either for increasing contrast or for characterizing starch dynamics. Use FPA50 for structural analysis and Carnoy's fixative for quantitative starch analysis. | ||
| Alexander staining | Ethanol 95% 10ml, malachite green (1% in 95% EtOH) 1 ml, fuchsin acid (1% in ddH2O) 5ml, orange G (1% in ddH2O) 0.5ml, phenol 5g, chloral hydrate 5g, glacial acetic acid 2ml, glycerol 25ml . This clearing/staining alone or in combination with Herr's 4½ solution can be used to evaluate pollen abortion in flowers with mature and tricellular pollen grains. It's used on freshly harved non-fixed material. | ||
| Staining solutions | |||
| Calcofluor solution | Calcofluor 0.007% in water (g:ml). Originally used as an optical brightner. Can be used for staining cellulose, carboxylated polysaccharides and callose in cell walls. Frequently used to stain the intine of the pollen grain. All three fixatives can be used with this solution. | ||
| Auramine solution | Auramine 0.01% in water (g:ml). This lipophilic fluorscent dye can be used for staining cuticles, cutin, and exine among others. All three fixatives can be used with this solution | ||
| Calcofluor-Auramine mixture | Auramine solution : Calcofluor solution, 3:1. Can be used for a combined staining by both solutions. Other proportions can be assayed maintaining a smaller proportion of calcofluor with respect to auramine. | ||
| DAPI solution | DAPI 0.4 ug/ml, 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 7), 0.1% Triton-X-100, 1 mM EDTA. This solution can be used for staining chromosome spreads during male and female meiosis, and cell nuclei of any tissue. Frequently used for studying pollen grain development. Carnoy's and methanol/ acetic acid are the best fixatives for this solution. Formaldehyde-based fixatives such as FPA50 may interfere with the staining. Excitation in the UV and maximum emission around 461 nm. | ||
| Sodium phosphate buffer (0.1 M) | Proton receptor: 0.2 M Na2HPO4, proton donor: 0.2 M NaH2PO4, ratio proton donor / proton receptor: 1.364 ( for a pH 7) | ||
| Aniline blue solution | 0.1% (w/v) aniline blue, 108 mM K3PO4 (pH 11), 2% glycerol. This solution can be used for staining callose and cellulose of many stages of development (e.g callose deposition in male and female terads, callose plugs in pollen tubes). Excitation in the UV and maximum emission around 455. It can also be excited at 514 nm with emission in the red for cell content staining. |
References
- Crane, P. R., Friis, E. M., Pedersen, K. R. The origin and early diversification of angiosperms. Nature. 374 (6517), 27-33 (1995).
- Friedman, W. E. The meaning of Darwin’s ‘abominable mystery’. Am J Bot. 96 (1), 5-21 (2009).
- Sun, G., Dilcher, D. L., Zheng, S., Zhou, Z. In search of the first flower: A Jurassic angiosperm, Archaefructus, from Northeast China. Science. 282 (5394), 1692-1695 (1998).
- Mulcahy, D. L. The rise of the angiosperms: a genecological factor. Science. 206 (4414), 20-23 (1979).
- Friedman, W. E., Moore, R. C., Purugganan, M. D. The evolution of plant development. Am J Bot. 91 (10), 1726-1741 (2004).
- Endress, P. K., Soltis, D., Soltis, P., Leebens-Mack, J. Angiosperm floral evolution: morphological developmental framework. Advances in botanical research Volume 44: Developmental genetics of the flower. , 1-61 (2006).
- Alvarez-Buylla, E. R., et al. Flower development. Arabidopsis Book. 8, 30127 (2010).
- Beddington, J. Food security: contributions from science to a new and greener revolution. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 365 (1537), 61-71 (2010).
- Godfray, H. C., et al. Food security: The challenge of feeding 9 billion people. Science. 327 (5967), 812-818 (2010).
- Burkle, L. A., Alarcón, R. The future of plant-pollinator diversity: understanding interaction networks across time, space, and global change. Am J Bot. 98 (3), 528-538 (2011).
- Meyerowitz, E. M., et al. A genetic and molecular model for flower development in Arabidopsis thaliana. Dev Suppl. 1, 157-167 (1991).
- Hafidh, S., Fíla, J., Honys, D. Male gametophyte development and function in angiosperms: a general concept. Plant Reprod. 29 (1-2), 31-51 (2016).
- Schmidt, A., Schmid, M. W., Grossniklaus, U. Plant germline formation: common concepts and developmental flexibility in sexual and asexual reproduction. Development. 142 (2), 229-241 (2015).
- Sprunck, S., Dresselhaus, T. Three cell fusions during double fertilization. Cell. 161 (4), 708-709 (2015).
- Dresselhaus, T., Sprunck, S., Wessel, G. M. Fertilization mechanisms in flowering plants. Curr Biol. 26 (3), R125-R139 (2016).
- Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M. Early flower development in Arabidopsis. Plant Cell. 2 (8), 755-767 (1990).
- Roeder, A. H., Yanofsky, M. F. Fruit development in Arabidopsis. Arabidopsis Book. 4, e0075 (2006).
- Hama, H., et al. Scale, a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat Neurosci. 14 (11), 1481-1488 (2011).
- Ke, M. -. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB. a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nat Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
- Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nat Methods. 10 (6), 508-513 (2013).
- Lee, E., et al. ACT-PRESTO: rapid and consistent tissue clearing and labeling method for 3-dimensional (3D) imaging. Sci Rep. 6, 18631 (2016).
- Endress, P. K. Evolution and floral diversity: the phylogenetic surroundings of Arabidopsis and Antirrhinum. Int J Plant Sci. 153 (3, Part 2), S106-S122 (1992).
- Reyes-Olalde, J. I., Zuñiga-Mayo, V. M., Chávez Montes, R. A., Marsch-Martínez, N., de Folter, S. Inside the gynoecium: at the carpel margin. Trends Plant Sci. 18 (11), 644-655 (2013).
- Hill, J. P., Lord, E. M. Floral development in Arabidopsis thaliana: a comparison of the wild type and the homeotic pistillata mutant. Can J Bot. 67 (10), 2922-2936 (1989).
- Sessions, R. A., Zambryski, P. C. Arabidopsis gynoecium structure in the wild type and in ettin mutants. Development. 121 (5), 1519-1532 (1995).
- Schneitz, K., Hülskamp, M., Pruitt, R. E. Wild-type ovule development in Arabidopsis thaliana: a light microscope study of cleared whole-mount tissue. Plant J. 7 (5), 731-749 (1995).
- Sundberg, E., Ferrándiz, C., Østergaard, L. Gynoecium patterning in Arabidopsis: a basic plan behind a complex structure. Annual Plant Reviews Volume 38: Fruit Development and Seed Dispersal. , 35-69 (2009).
- Meinke, D. W. 10 seed development in Arabidopsis thaliana. Cold Spring Harbor Monograph Archive. 27, 253-295 (1994).
- Weigel, D., Glazebrook, J. . Arabidopsis: a laboratory manual. , (2002).
- Herr, J. M. A new clearing-squash technique for the study of ovule development in angiosperms. Am J Bot. 58 (8), 785-790 (1971).
- Alexander, M. P. A versatile stain for pollen fungi, yeast and bacteria. Stain Technol. 55 (1), 13-18 (1980).
- Herr, J. M. Applications of a new clearing technique for the investigation of vascular plant morphology. J Elisha Mitchell Sci Soc Chapel Hill N C. 88 (3), 137-143 (1972).
- Herr, J. M., Goldman, C. A., Hauta, P. L., O’Donnell, M. A., Andrews, S. E., van der Heiden, R. Clearing techniques for the study of vascular plant tissues in whole structures and thick sections. Tested studies for laboratory teaching. Proceedings of the Fifth Workshop/Conference of the Association for Biology Laboratory Education (ABLE). 5, 63-84 (1993).
- Colcombet, J., Boisson-Dernier, A., Ros-Palau, R., Vera, C. E., Schroeder, J. I. Arabidopsis somatic embryogenesis receptor kinases1 and 2 are essential for tapetum development and microspore maturation. Plant Cell. 17 (12), 3350-3361 (2005).
- Heslop-Harrison, J., Heslop-Harrison, Y., Shivanna, K. R. The evaluation of pollen quality and a further appraisal of the fluorochromatic (FCR) test procedure. Theor Appl Genet. 67 (4), 367-379 (1984).
- Stone, J. L., Thomson, J. D., Dent-Acosta, S. J. Assessment of pollen viability in handpollination experiments: A review. Amer J Bot. 82 (9), 1186-1197 (1995).
- Dafni, A., Firmage, D. Pollen viability and longevity: practical, ecological and evolutionary implications. Plant Syst Evol. 222 (1-4), 113-132 (2000).
- Lora, J., Testillano, P. S., Risueño, M. C., Hormaza, J. I., Herrero, M. Pollen development in Annona cherimola Mill. (Annonaceae). Implications for the evolution of aggregated pollen. BMC Plant Biol. 9, 129 (2009).
- Ross, K. J., Fransz, P., Jones, G. H. A light microscopic atlas of meiosis in Arabidopsis thaliana. Chromosome Res. 4 (7), 507-516 (1996).
- Park, S. K., Howden, R., Twell, D. The Arabidopsis thaliana gametophytic mutation gemini pollen1 disrupts microspore polarity, division asymmetry and pollen cell fate. Development. 125 (19), 3789-3799 (1998).
- Haseloff, J. Old botanical techniques for new microscopes. BioTechniques. 34 (6), 1174-1182 (2003).
- Truernit, E., et al. High-resolution whole-mount imaging of three-dimensional tissue organization and gene expression enables the study of phloem development and structure in Arabidopsis. Plant Cell. 20 (6), 1494-1503 (2008).
- Hedhly, A., et al. Starch turnover and metabolism during flower and early embryo development. Plant Physiol. 172 (4), 2388-2402 (2016).
- Crane, C. F., Carman, J. G. Mechanisms of apomixis in Elymus rectisetus from eastern Australia and New Zealand. Am J Bot. 74 (4), 477-496 (1987).
- Young, B. A., Sherwood, R. T., Bashaw, E. C. Cleared-pistil and thick-sectioning techniques for detecting aposporous apomixis in grasses. Can J Bot. 57 (15), 1668-1672 (1979).
- Kurihara, D., Mizuta, Y., Sato, Y., Higashiyama, T. ClearSee: a rapid optical clearing reagent for whole-plant fluorescence imaging. Development. 142, 4168-4179 (2015).
- Warner, C. A., et al. An optical clearing technique for plant tissues allowing deep imaging and compatible with Fluorescence Microscopy. Plant Phys. 166, 1684-1687 (2014).
- Hasegawa, J., Sakamoto, Y., Nakagami, S., Aida, M., Sawa, S., Matsunaga, S. Three-dimensional imaging of plant organs using a simple and rapid transparency technique. Plant Cell Physiol. 57 (3), 462-472 (2016).
- Musielak, T. J., Slane, D., Liebig, C., Bayer, M. A Versatile Optical Clearing Protocol for Deep Tissue Imaging of Fluorescent Proteins in Arabidopsis thaliana. PLoS ONE. 11 (8), e0161107 (2016).
