Whole-mount y coloración de silicuas y órganos flor de Arabidopsis
Summary
En este protocolo, describimos las técnicas para la adecuada disección de flores de Arabidopsis y silicuas, algunas técnicas de compensación básica y seleccionado procedimientos de observaciones del conjunto de montaje de estructuras reproductivas de tinción.
Abstract
Debido a sus formidables herramientas para los estudios genéticos moleculares, thaliana de Arabidopsis es una de las especies más destacadas del modelo en biología de plantas y, especialmente, en la biología reproductiva de plantas. Sin embargo, planta anatómica, morfológica y análisis ultraestructurales implican tradicionalmente lentos incrustar y seccionamiento procedimientos para campo brillante, análisis y microscopia electrónica. Recientes avances en la microscopía de fluorescencia confocal 3D asistido por ordenador microscópicos análisis de estado de la técnica y el refinamiento continuo de técnicas moleculares para ser utilizado en muestras mínimamente procesadas, todo Monte, ha llevado a una mayor demanda de desarrollo de técnicas de procesamiento de muestra eficiente y mínimo. En este protocolo, describen técnicas para disecar correctamente flores de Arabidopsis y silicuas, claro técnicas básicas y algunos procedimientos de tinción para montaje todo observaciones de estructuras reproductivas.
Introduction
Flores están definiendo entre los más importantes órganos de las angiospermas. Plantas con flores aparecieron hace unos 90 millones años1y tan rápido que su aparición rápida fue descrito como un “misterio abominable” por Charles Darwin2. El interés de los investigadores de planta en el desarrollo de la flor son diverso. Algunas investigaciones se ha centrado en comprender el origen evolutivo de la flor como un todo, o la evolución de características anatómicas, estructurales y funcionales de flores3,4,5,6 . La alta variación en forma floral y estructura, así como los modos de reproducción sexual y asexual, confiando en ellos, hacer la flor una estructura altamente compleja. Esto ha llevado a diversos esfuerzos por caracterizar las anatomía y características estructurales de los órganos florales, técnicas de luz y electrónica microscópica que podría combinarse con la investigación genética y molecular7. Además, como fuente de frutos y semillas, las flores son de suma importancia para la nutrición humana y animal. Por lo tanto, la caracterización del desarrollo de la flor y la fruta tiene muchas implicaciones para la investigación aplicada, incluyendo la seguridad alimentaria de una población humana creciente y las estrategias de conservación ecológica en un cambiante ambiente8 , 9 , 10.
Desarrollo de la flor en Arabidopsis comienza con la inducción floral y la transformación de lo meristemo vegetativo a un meristemo de la inflorescencia (grupo de flores). Primordios de flores se inician lateralmente en el flanco de la inflorescencia meristem11. Los primordios de órganos florales forman progresivamente en verticilos concéntricos desde el exterior al centro de la flor y eventualmente convierten en sépalos, pétalos, estambres y carpelos7. Estos órganos florales cumplen protección nutritiva, distinta y funcional (por ejemplo, atracción de polinizadores) papeles en diferentes especies de plantas, con los órganos sexuales, sostener el desarrollo de los gametofitos masculinos y femeninos, respectivamente12 , 13. los gametofitos, a su vez, cada uno distinguen un par de hombre (espermatozoides) y los gametos femeninos (óvulo y célula central), que se unen con doble fertilización para formar la próxima generación, el zigoto y el endosperma primario, un soporte de tejido terminal la desarrollo del embrión14,15. Apoyo al desarrollo de frutos y semillas el crecimiento, maduración y conservación del embrión y, eventualmente, su dispersión. Se ha realizado una amplia investigación para caracterizar el desarrollo flor y embriones de diversas especies, especialmente en la especie modelo Arabidopsis7,16,17.
Primeros análisis microscópicos del desarrollo de la flor se basaron en la observación técnicas tal como parafina o incrustación de resina y seccionamiento, combinación con la luz o la microscopía electrónica y procesamiento de las muestras requiere mucho tiempo. Estas técnicas microscópicas tradicionales fueron utilizadas a menudo en combinación con las investigaciones genéticas moleculares, como el análisis microscópicos de mutantes, la localización del ARN mediante hibridación en situ o la inmuno detección de proteínas. Recientes avances en microscopía de fluorescencia confocal y de amplio campo, en análisis de imagen asistido por ordenador 3D de estado de la técnica y el refinamiento continuo de los métodos moleculares que pueden utilizarse en muestras mínimamente procesadas, todo Monte, ha llevado a la necesidad de técnicas de procesamiento de muestra eficiente y mínimo que son preferentemente susceptibles de análisis cuantitativos. En los últimos años ha realizado progresos significativos en el desarrollo de técnicas claro espécimen animal montaje en conjunto. Procesar la muestra transparente mediante reactivos de urea o azúcar-base acuosa (p. ej., escala, SeeDB, cúbico)18,19,20, o eliminando selectivamente lípidos (usando el detergente SDS) después de inclusión de muestras en hidrogeles estables; la eliminación de lípidos puede lograr ya sea por difusión pasiva (p. ej., modificado claridad protocolo21, pacto-PARS-llantas22) o activamente por electroforesis (original claridad protocolo23 y24de la ley-PRESTO). Alentado por este progreso rápido, algunas técnicas derivadas también están surgiendo para su uso en las plantas.
En este trabajo métodos centrado en el modelo de Arabidopsis, describimos el procedimiento para la adecuada disección de capullos, flores y jóvenes silicuas y claro de todo Monte muestras para coloración diversa y procedimientos de observación mediante clásico o un método reciente de compensación basada en la SDS. Se dan ejemplos para almidón, Callosa y la coloración de la cromatina. Aunque estos procedimientos pueden necesitar más mejoras y adaptaciones cuando se utiliza con otras especies, esperamos se fijaron la etapa para la investigación adicional sobre estos métodos simples pero fundamentales que son el punto de partida de muchos proyectos de investigación.
Protocol
Representative Results
Discussion
La existencia de muchos brotes de flor en una inflorescencia simple de Arabidopsis, que abarca todas las etapas del desarrollo flor, ofrece una oportunidad única para estudios tendientes a caracterizar un efecto de un tratamiento o una característica del desarrollo al mismo tiempo a través de las diferentes etapas de desarrollo de la flor. Un punto de referencia entre diferentes plantas individuales es la apertura de la primera flor de la inflorescencia principal. Las plantas son tratadas de tal manera que se…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por la Universidad de Zurich, un IEF Marie Curie Grant (grant no. TransEpigen-254797 a A.H.), una beca avanzada del Consejo Europeo de investigación (no de la concesión. Medea-250358 a U.G.) y un proyecto de investigación y desarrollo tecnológico (grant MecanX a U.G.) de SystemsX.ch, la iniciativa Suiza en biología de sistemas.
Materials
| Reagents and Materials | |||
| Ethanol | Scharlau | ET00102500 | |
| Acetic Acid | Applichem | A3686,2500 | 100% Molecular biology grade |
| Glacial Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 320099 | Molecular Biology Grade |
| Methanol | Scharlau | ME03062500 | |
| Formaldehyde Solution | Sigma-Aldrich | F1635 | |
| Propionic acid | Sigma-Aldrich | 81910-250 ml | |
| Chloral hydrate | Sigma-Aldrich | 15307 | |
| Glycerol | Roth | 3783.1 | |
| Gum arabic | Fluka | 51198 | |
| Lactic acid | Fluka | 69773 | |
| Phenol | Sigma-Aldrich | 77607-250ML | We used liquid phenol (use the density to find the required volume for your solution) |
| Clove oil | Sigma-Aldrich | C8392-100ML | |
| Xylene | Roth | 4436.1 | |
| Iodine | Fluka | 57665 | |
| Potassium iodide | Merck | 5043 | |
| Malachite Green | Fluka | 63160 | |
| Fuchsin acid | Fluka | 84600 | |
| Orange G | Sigma | 7252 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | Molecular Biology Grade |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 71690 | |
| Sodium di-Hydrogen Phosphate | Applichem | A1047,1000 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S9763-1KG | |
| Potassium phosphate | Sigma-Aldrich | 04347 | |
| EDTA | Applichem | A2937,1000 | |
| Calcofluor | Sigma | F6259 | Fluorescent brightener 28 |
| Auramine | Chroma | 10120 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | toxic |
| Triton-X-100 | Sigma | T8787 | |
| Aniline blue | Merck | 1275 | |
| MS medium | Carolina | 19-57030 | |
| Nutrient-rich substrate | Einheitserde | ED73 | |
| Watch maker's glass | No specific brand | ||
| 15 ml falcon centrifuge tubes | VWR | 62406-200 | |
| Dumond Forceps | Actimed | 0208-5SPSF-PS | |
| Forceps | DUMONT BIOLOGY | 0108-5 | |
| Syringe | BD | BD Plastipak 300013 | 1 ml |
| Preparation needle | BD | BD Microlance 304000 | |
| Microscope slides | Thermo Scientific | 10143562CE | cut edges |
| Coverslips | Thermo Scientific | DV40008 | |
| Humid box | A plastic box with damp paper towel and slide supports inside | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions | |||
| Fixatives | |||
| Carnoy's (Farmer's) fixative | Absolute ethanol : glacial acetic acid, 3:1 (ml:ml) | ||
| Methanol/acetic acid fixative | 50 % (v/v) methanol, 10 % (v/v) glacial acetic acid in deionized water | ||
| FPA50 fixative | Formalin, propionic acid, 50% ethanol; 5:5:90 (ml:ml:ml) | ||
| Clearing solutions | |||
| Chloral hydrate/glycerol | Chloral hydrate : glycerol : water, 8:1:2 (g:ml:ml). Can be used for all flower developmental stages and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50 | ||
| Modified Hoyer | Gum arabic 7.5 g, chloral hydrate 100 g, glycerol 5 ml , water 30 ml. Can be used for all flower developmental stages and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50 | ||
| Herr's 4½ clearing fluid | Lactic acid, chloral hydrate, phenol crystals, clove oil, xylene; 2:2:2:2:1, by weight. Can be used for all flower developmental stages (especially for stamen development) and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50 | ||
| SDS/NaOH solution | Mix-dilute the the SDS and the NaOH stock solution to 1% SDS / 0.2 N NaOH (10x dilution). For all stages of flower and silique developmental stages. The best fixative is the methano/acetic acid fixative; the other two fixatives can also be used. Can be combined with calcofluor, auramine, DAPI, and aniline blue staining solution. | ||
| SDS stock solution | 10 % (w/v) sodium dodecyl sulphate. Dissolve 10 g sodium dodecyl sulphate in 80 ml deionized water and make up to 100 ml with deionized water. | ||
| NaOH stock solution | 2 N NaOH solution: dissolve 4 g of NaOH in 40 ml of deionized water and make up to 100 ml with deionized water | ||
| Combined clearing and staining solutions | |||
| Herr's IKI-4½ | To a standard 4½ (9 g in total) add: 100 mg iodine, 500 mg potassium iodide. This clearing solution can be used for all flower developmental stages and for silique development, either for increasing contrast or for characterizing starch dynamics. Use FPA50 for structural analysis and Carnoy's fixative for quantitative starch analysis. | ||
| Alexander staining | Ethanol 95% 10ml, malachite green (1% in 95% EtOH) 1 ml, fuchsin acid (1% in ddH2O) 5ml, orange G (1% in ddH2O) 0.5ml, phenol 5g, chloral hydrate 5g, glacial acetic acid 2ml, glycerol 25ml . This clearing/staining alone or in combination with Herr's 4½ solution can be used to evaluate pollen abortion in flowers with mature and tricellular pollen grains. It's used on freshly harved non-fixed material. | ||
| Staining solutions | |||
| Calcofluor solution | Calcofluor 0.007% in water (g:ml). Originally used as an optical brightner. Can be used for staining cellulose, carboxylated polysaccharides and callose in cell walls. Frequently used to stain the intine of the pollen grain. All three fixatives can be used with this solution. | ||
| Auramine solution | Auramine 0.01% in water (g:ml). This lipophilic fluorscent dye can be used for staining cuticles, cutin, and exine among others. All three fixatives can be used with this solution | ||
| Calcofluor-Auramine mixture | Auramine solution : Calcofluor solution, 3:1. Can be used for a combined staining by both solutions. Other proportions can be assayed maintaining a smaller proportion of calcofluor with respect to auramine. | ||
| DAPI solution | DAPI 0.4 ug/ml, 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 7), 0.1% Triton-X-100, 1 mM EDTA. This solution can be used for staining chromosome spreads during male and female meiosis, and cell nuclei of any tissue. Frequently used for studying pollen grain development. Carnoy's and methanol/ acetic acid are the best fixatives for this solution. Formaldehyde-based fixatives such as FPA50 may interfere with the staining. Excitation in the UV and maximum emission around 461 nm. | ||
| Sodium phosphate buffer (0.1 M) | Proton receptor: 0.2 M Na2HPO4, proton donor: 0.2 M NaH2PO4, ratio proton donor / proton receptor: 1.364 ( for a pH 7) | ||
| Aniline blue solution | 0.1% (w/v) aniline blue, 108 mM K3PO4 (pH 11), 2% glycerol. This solution can be used for staining callose and cellulose of many stages of development (e.g callose deposition in male and female terads, callose plugs in pollen tubes). Excitation in the UV and maximum emission around 455. It can also be excited at 514 nm with emission in the red for cell content staining. |
References
- Crane, P. R., Friis, E. M., Pedersen, K. R. The origin and early diversification of angiosperms. Nature. 374 (6517), 27-33 (1995).
- Friedman, W. E. The meaning of Darwin’s ‘abominable mystery’. Am J Bot. 96 (1), 5-21 (2009).
- Sun, G., Dilcher, D. L., Zheng, S., Zhou, Z. In search of the first flower: A Jurassic angiosperm, Archaefructus, from Northeast China. Science. 282 (5394), 1692-1695 (1998).
- Mulcahy, D. L. The rise of the angiosperms: a genecological factor. Science. 206 (4414), 20-23 (1979).
- Friedman, W. E., Moore, R. C., Purugganan, M. D. The evolution of plant development. Am J Bot. 91 (10), 1726-1741 (2004).
- Endress, P. K., Soltis, D., Soltis, P., Leebens-Mack, J. Angiosperm floral evolution: morphological developmental framework. Advances in botanical research Volume 44: Developmental genetics of the flower. , 1-61 (2006).
- Alvarez-Buylla, E. R., et al. Flower development. Arabidopsis Book. 8, 30127 (2010).
- Beddington, J. Food security: contributions from science to a new and greener revolution. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 365 (1537), 61-71 (2010).
- Godfray, H. C., et al. Food security: The challenge of feeding 9 billion people. Science. 327 (5967), 812-818 (2010).
- Burkle, L. A., Alarcón, R. The future of plant-pollinator diversity: understanding interaction networks across time, space, and global change. Am J Bot. 98 (3), 528-538 (2011).
- Meyerowitz, E. M., et al. A genetic and molecular model for flower development in Arabidopsis thaliana. Dev Suppl. 1, 157-167 (1991).
- Hafidh, S., Fíla, J., Honys, D. Male gametophyte development and function in angiosperms: a general concept. Plant Reprod. 29 (1-2), 31-51 (2016).
- Schmidt, A., Schmid, M. W., Grossniklaus, U. Plant germline formation: common concepts and developmental flexibility in sexual and asexual reproduction. Development. 142 (2), 229-241 (2015).
- Sprunck, S., Dresselhaus, T. Three cell fusions during double fertilization. Cell. 161 (4), 708-709 (2015).
- Dresselhaus, T., Sprunck, S., Wessel, G. M. Fertilization mechanisms in flowering plants. Curr Biol. 26 (3), R125-R139 (2016).
- Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M. Early flower development in Arabidopsis. Plant Cell. 2 (8), 755-767 (1990).
- Roeder, A. H., Yanofsky, M. F. Fruit development in Arabidopsis. Arabidopsis Book. 4, e0075 (2006).
- Hama, H., et al. Scale, a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat Neurosci. 14 (11), 1481-1488 (2011).
- Ke, M. -. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB. a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nat Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
- Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nat Methods. 10 (6), 508-513 (2013).
- Lee, E., et al. ACT-PRESTO: rapid and consistent tissue clearing and labeling method for 3-dimensional (3D) imaging. Sci Rep. 6, 18631 (2016).
- Endress, P. K. Evolution and floral diversity: the phylogenetic surroundings of Arabidopsis and Antirrhinum. Int J Plant Sci. 153 (3, Part 2), S106-S122 (1992).
- Reyes-Olalde, J. I., Zuñiga-Mayo, V. M., Chávez Montes, R. A., Marsch-Martínez, N., de Folter, S. Inside the gynoecium: at the carpel margin. Trends Plant Sci. 18 (11), 644-655 (2013).
- Hill, J. P., Lord, E. M. Floral development in Arabidopsis thaliana: a comparison of the wild type and the homeotic pistillata mutant. Can J Bot. 67 (10), 2922-2936 (1989).
- Sessions, R. A., Zambryski, P. C. Arabidopsis gynoecium structure in the wild type and in ettin mutants. Development. 121 (5), 1519-1532 (1995).
- Schneitz, K., Hülskamp, M., Pruitt, R. E. Wild-type ovule development in Arabidopsis thaliana: a light microscope study of cleared whole-mount tissue. Plant J. 7 (5), 731-749 (1995).
- Sundberg, E., Ferrándiz, C., Østergaard, L. Gynoecium patterning in Arabidopsis: a basic plan behind a complex structure. Annual Plant Reviews Volume 38: Fruit Development and Seed Dispersal. , 35-69 (2009).
- Meinke, D. W. 10 seed development in Arabidopsis thaliana. Cold Spring Harbor Monograph Archive. 27, 253-295 (1994).
- Weigel, D., Glazebrook, J. . Arabidopsis: a laboratory manual. , (2002).
- Herr, J. M. A new clearing-squash technique for the study of ovule development in angiosperms. Am J Bot. 58 (8), 785-790 (1971).
- Alexander, M. P. A versatile stain for pollen fungi, yeast and bacteria. Stain Technol. 55 (1), 13-18 (1980).
- Herr, J. M. Applications of a new clearing technique for the investigation of vascular plant morphology. J Elisha Mitchell Sci Soc Chapel Hill N C. 88 (3), 137-143 (1972).
- Herr, J. M., Goldman, C. A., Hauta, P. L., O’Donnell, M. A., Andrews, S. E., van der Heiden, R. Clearing techniques for the study of vascular plant tissues in whole structures and thick sections. Tested studies for laboratory teaching. Proceedings of the Fifth Workshop/Conference of the Association for Biology Laboratory Education (ABLE). 5, 63-84 (1993).
- Colcombet, J., Boisson-Dernier, A., Ros-Palau, R., Vera, C. E., Schroeder, J. I. Arabidopsis somatic embryogenesis receptor kinases1 and 2 are essential for tapetum development and microspore maturation. Plant Cell. 17 (12), 3350-3361 (2005).
- Heslop-Harrison, J., Heslop-Harrison, Y., Shivanna, K. R. The evaluation of pollen quality and a further appraisal of the fluorochromatic (FCR) test procedure. Theor Appl Genet. 67 (4), 367-379 (1984).
- Stone, J. L., Thomson, J. D., Dent-Acosta, S. J. Assessment of pollen viability in handpollination experiments: A review. Amer J Bot. 82 (9), 1186-1197 (1995).
- Dafni, A., Firmage, D. Pollen viability and longevity: practical, ecological and evolutionary implications. Plant Syst Evol. 222 (1-4), 113-132 (2000).
- Lora, J., Testillano, P. S., Risueño, M. C., Hormaza, J. I., Herrero, M. Pollen development in Annona cherimola Mill. (Annonaceae). Implications for the evolution of aggregated pollen. BMC Plant Biol. 9, 129 (2009).
- Ross, K. J., Fransz, P., Jones, G. H. A light microscopic atlas of meiosis in Arabidopsis thaliana. Chromosome Res. 4 (7), 507-516 (1996).
- Park, S. K., Howden, R., Twell, D. The Arabidopsis thaliana gametophytic mutation gemini pollen1 disrupts microspore polarity, division asymmetry and pollen cell fate. Development. 125 (19), 3789-3799 (1998).
- Haseloff, J. Old botanical techniques for new microscopes. BioTechniques. 34 (6), 1174-1182 (2003).
- Truernit, E., et al. High-resolution whole-mount imaging of three-dimensional tissue organization and gene expression enables the study of phloem development and structure in Arabidopsis. Plant Cell. 20 (6), 1494-1503 (2008).
- Hedhly, A., et al. Starch turnover and metabolism during flower and early embryo development. Plant Physiol. 172 (4), 2388-2402 (2016).
- Crane, C. F., Carman, J. G. Mechanisms of apomixis in Elymus rectisetus from eastern Australia and New Zealand. Am J Bot. 74 (4), 477-496 (1987).
- Young, B. A., Sherwood, R. T., Bashaw, E. C. Cleared-pistil and thick-sectioning techniques for detecting aposporous apomixis in grasses. Can J Bot. 57 (15), 1668-1672 (1979).
- Kurihara, D., Mizuta, Y., Sato, Y., Higashiyama, T. ClearSee: a rapid optical clearing reagent for whole-plant fluorescence imaging. Development. 142, 4168-4179 (2015).
- Warner, C. A., et al. An optical clearing technique for plant tissues allowing deep imaging and compatible with Fluorescence Microscopy. Plant Phys. 166, 1684-1687 (2014).
- Hasegawa, J., Sakamoto, Y., Nakagami, S., Aida, M., Sawa, S., Matsunaga, S. Three-dimensional imaging of plant organs using a simple and rapid transparency technique. Plant Cell Physiol. 57 (3), 462-472 (2016).
- Musielak, T. J., Slane, D., Liebig, C., Bayer, M. A Versatile Optical Clearing Protocol for Deep Tissue Imaging of Fluorescent Proteins in Arabidopsis thaliana. PLoS ONE. 11 (8), e0161107 (2016).
