Umfassendes Protokoll zur Probe und Prozess des Knochenmarks zur Messung von messbaren Resterkrankung und leukämischen Stammzellen in der akuten myeloischen Leukämie

Das Protokoll folgt den Richtlinien der Forschung-Code und der Forschungsethikkommission der VU University Medical Center. (1) Knochenmark Aspiration und Probe-Vorbereitung Geduldig und materielle Vorbereitung Füllen Sie ein oder zwei 10 mL Spritzen mit 1 % Lidocain mit einer 16-Gauge-Nadel. Ersetzen Sie die Nadel für eine 21-Gauge-Nadel. Legen Sie zwei Tropfen 5 % EDTA auf einem Uhrglas. Glas-Objektträger eingerichtet (n = 15 mit konsequenten Patienten Nummerierung und Datum) für die Vorbereitung der Abstrich. Setzen Sie auf seitlichen Dekubitus Patienten. Suchen Sie die überlegene hintere Beckenkamm Wirbelsäule und mit Stift markieren.Hinweis: im Allgemeinen ist die posteriore superior Beckenkamm Wirbelsäule befindet sich einerseits breite distal zum Beckenkamm und einerseits breite seitlich an der Mittellinie. Bei Frauen kann die tatsächliche Wirbelsäule ein bisschen mehr seitliche, bei einigen Männern, die ein bisschen mehr mediale sein. Desinfizieren Sie die Haut mit Chlorhexidin 0,5-1 % in Ethanol aus der beabsichtigten Biopsie Bereich nach außen im Kreis. Öffnen Sie die Verpackung der sterile Handschuhe, sterile Handschuhe anziehen und legte das Paket auf den Tisch zu einen sterilen Bereich erstellen. Öffnen Sie das Paket mit der Aspiration-Nadel, und platzieren Sie es auf den sterilen Bereich. Haut und Unterhautgewebe und schließlich Periost zu infiltrieren. Verwalten Sie an der Knochenhaut das Lidocain in einer Weise, dass eine Fläche von 1 cm Durchmesser betäubt worden.Hinweis: Ausreichende Gabe von Lidocain, das Periost ist einer der wichtigsten Faktoren für hohen Patientenkomfort. Testen Sie, ob der Knochenhaut ausreichend betäubt wurden, hat durch Tippen auf den beabsichtigten Biopsie-Standort mit der eingeführten Nadel und Fragen Sie, ob der Patient keine Schmerzen spürt. Anmerkung: Kinder werden während des gesamten Verfahrens vollständig betäubt. Halten Sie die Nadel Absaugen (15 Ga x 2,8″) mit dem proximalen Ende in die Handfläche und Zeigefinger gegen die Seite der Nadel Metallschaft nahe der Spitze; Diese Position ermöglicht eine bessere Kontrolle. Einführen der Nadel mit einer rotierenden Bewegung (durch schnell wechselnde pronierenden/supinating Bewegung) durch die Haut in Richtung Beckenkamm Wirbelsäule und bringen Sie die Nadel in Kontakt mit der hinteren Beckenkamm Wirbelsäule. Sicher das heißt Nadel zu betäubten Bereich der Knochenhaut eingeführt wird; der Patient sollte nur Druck und keine Schmerzen fühlen. Wenn der Patient Schmerzen verspürt, positionieren Sie die Nadel zu oder verwalten Sie mehr Lidocain. Mit sanften, aber festen Druck, vorab die Nadel in eine abwechselnd im Uhrzeigersinn gegen Uhrzeigersinn drehen. Eingang in das Knochenmark Hohlraum wird in der Regel durch verringerten Widerstand erkannt. Entfernen Sie das Stilett aus der Nadel. Legen Sie eine leere Spritze 10 mL auf die Nadel. Negativer Druck durch den Rückzug der Spritzenkolben mit einem sanften Ruck. Warnen Sie dem Patienten, dass sie ein Gefühl Krämpfe und Schmerzen fühlen können, wenn Knochenmark aspiriert werden. Wenn nicht genügend Knochenmark Knochensplitter freigegeben sind, sollte ein weiteres Absaugen mit einem schnellen Zug durchgeführt werden. Die meisten Knochensplitter werden in den ersten 1-2 mL entnommen den ersten Zug. Aspirieren Sie nur 1-2 mL Verdünnen der Probe zur Vermeidung.Hinweis: Verdünnung führt zu Polopiryna und kann verwirren MRD Ergebnisse). Ziehen Sie die Spritze und ersetzen Sie der Mandrin in die Aspiration-Nadel zu. Werfen Sie Teil des Knochenmarks in einem Uhrglas und den Rest in eine 8 mL-Tube mit Heparin beschichtet.Hinweis: Invertieren Sie jedes Röhrchen sofort nach dem Anbringen der Knochenmark-Aspirat in die Probe Tube um adäquate Antikoagulation zu gewährleisten. Knochenmark-Koagulation ist oft die Ursache für ungeeignetes Material. Zusätzliche Knochenmark kann von der gleichen Stelle abgesaugt werden, aber vorzugsweise die Nadel 5-10 mm fortgeschritten ist, bevor eine neue Aspirat getroffen wird. Vorzugsweise sollten nicht mehr als 2 Ziehungen pro Aufnahme Ebene getroffen werden. Reservieren Sie sich die Rohre mit einer zunehmenden Zahl aus der ersten, zweiten und/oder in Folge zieht. Es ist gemeinsame Regel, die erste Ziehung für die wichtigsten diagnostischen Analyse zu verwenden. Alternativ die Nadel aus der Einfügung Ort zurückziehen und in den Hohlraum Knochenmark ein paar Millimeter außerhalb des ursprünglichen Einfügung Wiedereinführung und wiederholen Sie den Vorgang.Hinweis: Aspirieren Sie nicht mehr als 1-2 mL pro Zug, zur Vermeidung von Kontaminationen erhebliche Blut. Wiederholen Sie so oft wie Material benötigt wird. Wenn ausreichend Material für die spezifische klinische Studienprotokoll aspiriert ist entfernen Sie die Knochenmark Nadel.Hinweis: Im Falle eines sonst nur schwer oder langsam Knochenmark Bestrebungen kann die Verwendung von Spritzen, die vorab gespült mit Antigerinnungsmittel waren hilfreich sein. Führen Sie bei einem trockenen Hahn eine Trephine Biopsie, die nicht in den Anwendungsbereich dieser Handschrift ist. Prüfungsvorbereitung der Abstriche morphologische Wählen Sie für optimale morphologische Beurteilung Schwammnadeln (z.B. mit einem Kunststoffspachtel) aus dem Aspirat in das Uhrglas und legen Sie sie auf einen Objektträger. Sanft lege eine andere Glas-Folie über der Folie mit dem Knochenmark und schieben; vermeiden Sie jeglichen Druck.Hinweis: Nur bei sehr großen Knochenmark Knochensplitter kann leichter Druck ausgeübt werden, um die Dicke der Zelle Ausbreitung zu verringern. Das Verfahren profitiert von Hilfe von einen Assistenten, der die Probe Rohre verarbeiten kann. Genaue Kennzeichnung der Rohre mit der Patientennummer und Anzahl der sequentiellen Knochenmark Auslosung ist entscheidend. Trocknen Sie die Folie gründlich, und führen Sie dann möglicherweise Giemsa Grünwald Färbung (siehe Tabelle der Materialien). Unter dem Lichtmikroskop für Morphologie zu prüfen (siehe Abbildung 1).Hinweis: Abbildung 1A zeigt die Abstriche des gesunden Knochenmarks bestehend aus verschiedenen funktionalen Zelltypen während Abbildung 1 b einen AML-Patienten mit vorwiegend leukämischen Blasten. Um die verbleibenden leukämischen Belastung besser definieren zu können, muss die Immunphänotypisierung durchgeführt werden. 2. Transport von Material zur Weiterverarbeitung Vorbereitung der Proben für den transport Um sicherzustellen, dass das Material nicht undicht und die Rohre nicht brechen, gewährleisten korrekte Verpackung (siehe Abbildung 2).Hinweis: Von unseren und anderen Erfahrungen die Lebensfähigkeit der Zellen ist am besten erhalten, wenn das Knochenmark bei Raumtemperatur aufbewahrt wird. Für langfristige Transport erfolgt dies am besten über Zimmertemperatur “Gel-Pack” um Temperaturstabilität während des Transports zu unterstützen. Pakete zu beschriften und fügen Sie die richtigen Formulare zur Vermeidung von Verlust des Pakets, längeren Transport oder Umschalten des Patienten.Hinweis: Diese sollte mindestens enthalten: Patientendaten (Form 1). Dies sollte die Studie Zahl und allgemein das “Geburtsdatum” enthalten. Entscheidend für die richtige Verarbeitung des Materials nach der Ankunft am empfangenden Lab ist eine klare Aussage speziell angeforderte Laboranalyse (molekulare Diagnostik, Immunphänotypisierung, MRD etc.) auf diesem Formular. (Formular 2) Adresse und Telefon Nummer eines Ansprechpartners, und wenn nötig, Papiere für den Zoll. Zur Vermeidung von Verlust von Pakete auf dem Postweg benachrichtigt sendende Labor immer das empfangende Labor, das eine Probe gesendet wurde. “Track and Trace” wird empfohlen. Proben von anderen Instituten erhalten Stellen Sie sicher, dass die passende Logistik gibt es am Institut zu die Probe im Labor zu erhalten, sobald es am Institut geliefert wird.Hinweis: Für optimale logistische Organisation vorzugsweise eines Zentrallabors notwendig, die empfängt und sammelt alle Material aus der örtlichen Klinik und externe Krankenhäuser. Insbesondere ist das Zuweisen von Protokolle für Verteilung und klare Kommunikation mit dem Vorstand Labors unerlässlich. Nach Erhalt der Proben, genau beachten Sie die entsprechende Nummerierung in Papierform Formen und eine gesicherte Datenbank mit wichtigen Bereichen wie MRD-ID-Nummer, Trial spezifische ID-Nummer, Krankenhaus-Registrierungsnummer senden Institut, Geburtsdatum, material Typ (Knochenmark oder peripheren Blut), weißen Blutkörperchen (WBC), Datum der Knochenmarkaspiration, Datum der Messung der Probe und allfällige Bemerkungen relevant für die Qualität der Messung.Hinweis: Vorzugsweise diese Datenbank verfügt auch zusätzliche Daten enthalten (oder mit anderen Datenbanken verknüpft werden) der Analyseergebnisse und weitere Patientendaten wie Follow-up-Daten. (3) Flow Cytometer Setup Hinweis: Dieser Abschnitt basiert auf Euroflow Anweisungen. 11 Einrichten der Photomultiplier (PMT) Spannungen für FCS-SSC-Parameter und Ziel-Fluoreszenz-Kanäle Für FCS-SSC-Parameter das Durchflusszytometer starten und Ausführen der “Cytometer Setup und Tracking (CST)” führen auf das Durchflusszytometer mit CST Perlen (siehe Tabelle der Materialien). Lyse der roten Blutkörperchen eines gesunden Spenders (beschrieben in Abschnitt 4.1). Erstellen eines neuen Experiments (im Menü: Experiment, neue experimentieren, wählen Sie leere Experiment) mit der Software des Herstellers (siehe Tabelle der Materialien) mit ein Forward Scatter (FSC) gegen seitliche (SSC) Dot Streudiagramm für die FSC und SSC Parameter einrichten. Dieses Experiment FSC/SCC PMT mit dem Datum zu nennen. Verwenden Sie zuerst die aktuelle Cytometer Einstellungen (Rechte Maustaste: “Bewerben aktuelle CST”). Diese Einstellungen sind mit den CST-Performance-Check mit CST-Kalibrierung Perlen (siehe Tabelle der Materialien) generiert worden. Passen Sie FSC und SSC um die Lymphozyten in “globales Experiment Settings” zu visualisieren. Hinweis: in unserem Durchflusszytometer sind 285 V und 400 V bzw.. Abhaken “Kompensation zu ermöglichen”,: Inspektor/Instrument Einstellungen/Entschädigung. Zur Beurteilung der Größe der Zellen (FSC) und Granularität (SSC) lysiert Start messen unbeschriftete peripheren Blutzellen durch die Funktion “Zellen zu erwerben”. Tor der Lymphozyten und anpassen/fein-tune FSC und SSC Spannungen, die folgenden mittleren Zielwerte für die gated Lymphozytenpopulation zu erreichen: FSC: 100.000 (Bereich 95.000 105.000); SSC: 15.000 (Bereich 13.000-17.000). Erwerben und durch die Messung mindestens 10.000 Ereignisse aufzuzeichnen. Überprüfen Sie den Mittelwert FSC und SSC Zielwerte für nichtöffentliche Lymphozyten und ggf. neu einstellen. Für die Einrichtung der Ziel-Fluoreszenz verwendet Kanäle PMT Spannungen 8-Gipfel Regenbogen Perlen Kalibrierung Partikel (siehe Tabelle der Materialien). Erstellen Sie ein neues Experiment auf die FACS für 7-Gipfel. Erstellen Sie ein Arbeitsblatt “Ziel bedeuten Fluoreszenz Intensität (MFI)” mit allen notwendigen Punkt plottet (n = 2; FSC gegen SSC, FITC gegen PE), Histogramme (n = 8; ein Histogramm für jeden Fluoreszenz-Detektor) und Statistik zeigt die Referenz Spitzenwerte (MFI und Variationskoeffizienten (CV)) für jeden Kanal Fluoreszenz. Bereiten Sie frisch eine Lösung mit 1 Tropfen (± 60 µL) Regenbogen Perlen in 1 mL dH2O. sanft Wirbel, die Perlen in Lösung zu mischen. Verwenden Sie die PMT-Einstellungen der FSC/SSC Spannungen von oben und Messung der Fluoreszenz der Regenbogen Perlen mit der “acquire” Funktion (ohne Aufnahme) mit “LOW”-Flow Rate mit einer Schwelle von 5.000. Verwenden Sie den Button”rechteckigen Tor” zum Tor der Singulett Perlen Bevölkerung P1 in der FSC gegen SSC-Dot-Plot. Tor der 7th PEAK – Bevölkerung P2 in der IRB im Vergleich zu PE-Dot-Plot. Weiterhin die Übernahme der 7-Peaks Regenbogen Perlen Federung und anpassen/fein-tune PMT Spannungen in allen Kanälen der Fluoreszenz MFI Zielwerte nach kommentierte MFI Ziel Kanäle zu erreichen, wie mit Perlen versehen. “Record” verwenden, um Daten von ca. 10.000 Veranstaltungen sammeln und prüfen der MFI für 7th Peak Perlen. Korrigieren Sie die PMT-Spannungen bei Bedarf. Einmal Ziel MFI-Werte für die 7th -Peak erreicht, Datensatz/Überschreiben der Datei für die Finale PMT-Werte. Speichern Sie die Finale PMT-Werte und benennen Sie die Datei speichern PMT Setup mit dem Datum, werden in den Katalog der Software des Herstellers. Verwenden Sie dieses PMT Setup für die Korrektur der Spill über für jede Fluoreszenz-Farbstoff. Fluoreszenz Kompensation Einstellungen Beschriften Sie ein Rohr für die ungefärbten Kontrolle und jeder Fluorochrom konjugierten Antikörper (siehe Tabelle S1 für die verwendeten Fluorochromes). Pipette 100 µL Puffer in jedes Rohr. Wirbel der Durchstechflasche mit mehrfarbigen Entschädigung Perlen (siehe Tabelle der Materialien) gründlich und fügen Sie dann 1 volle Tropfen (± 60 µL) dieser Perlen für jedes Rohr.Hinweis: Vermeiden Sie die Perlen auf der Seite des Rohres während der Aufnahme in jedes Rohr tropft. Dies kann zu niedrigen Wulst Konzentration führen und könnte Auswirkungen auf die Ergebnisse der Entschädigung Matrix. Pipette das entsprechende Volumen für einen Test von Fluorochrom-konjugierten Antikörpern ausreichend berechnet (das wäre ausreichend, um 106 Zellen färben) in die entsprechenden Rohr- und Wirbel gründlich. Die ungefärbten Kontrollröhrchen keine Antikörper hinzu. 15 bis 30 min. im Dunkeln bei Raumtemperatur (RT) inkubieren. Fügen Sie 4 mL Waschpuffer (Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS)/0.05% azide-0.1% human Serumalbumin (HSA) (siehe Tabelle der Materialien)) für jedes Rohr. Zentrifugieren Sie die Rohre bei 300g für 10 min. Überstands entfernen und Aufschwemmen der Wulst Pellet durch Zugabe von 0,2 mL Waschpuffer für jedes Rohr. Wirbel die Rohre gründlich. Analyse-Software des Herstellers zu öffnen (siehe Tabelle der Materialien) und erstellen Sie ein neues Experiment (im Menü: Experiment, neue experimentieren, wählen Sie leere Experiment) und benennen Sie als Entschädigung Datei mit aktuellen Datum. Gehen Sie zu “Cytometer Einstellungen” und verwenden Sie die PMT-Einstellung von Abschnitt 3.1. Achten Sie darauf, dass der Schwellenwert in FSC 5.000 und die Kompensationswerte von den verwendeten Fluorochromes gleich Null sind. Entschädigung-Steuerelemente, einschließlich Label-spezifische Röhren, je nach Bedarf zu erstellen. Achten Sie darauf, einen ungefärbten Steuerelement enthalten. Wählen Sie aus dem Menü: Experiment, Entschädigung Setup erstellen Entschädigung Kontrollen. Laden Sie die ungefärbten Kontrollröhrchen und passen Sie das P1 Tor um den Singulett-Perlenpopulation und sicherstellen Sie, dass die P1-Tor nur Singulett Perlen enthält. Mit der rechten Maustaste des P1-Tores, und wählen Sie “Gelten für alle Entschädigung Steuerelemente”. Datenaufzeichnung für alle single beschrifteten Fluoreszenz-Röhren. Vergewissern Sie sich, dass P2 Tor die positiven Bevölkerung auf jeder Fluoreszenz-Histogramm umfasst. Wenn nötig, passen Sie das Tor. Die Entschädigung zu berechnen. Wählen Sie Experiment, Entschädigung Setup berechnen Entschädigung. Wenn die Entschädigungsberechnung nicht erfolgreich ist, wird eine Fehlermeldung angezeigt. Die erforderlichen Anpassungen vornehmen und neu berechnen. Wenn die Entschädigungsberechnung erfolgreich ist, erscheint ein Dialog Abfrage für den Namen für die Entschädigung-Setup. Geben Sie einen Namen (zum Beispiel YY-MM-DD 8 Farbe Setup) und klicken Sie auf, verknüpfen und speichern. Das Ersatz-Setup wird auch zum Ausgleich Setup Katalog gespeichert werden.Hinweis: Die gleichen Einstellungen können für alle Experimente mit der gleichen Fluorophore verwendet werden. (4) Flow Cytometry Bewertung (LAIP und LSC) Hinweis: Hier beschreiben wir die Masse Lyse Verfahren vor Färbung, ermöglicht es, um eine bevorzugte Konzentration des WBC zu beflecken. Die meisten MRD Protokolle verwenden Sie diese Vorgehensweise, obwohl einige andere Optionen wie Verfärbungen vor Lyse erfolgreich eingesetzt haben. Ganze Knochenmark vor Lyse Färbung minimiert bevorzugte Zelle Verlust12, hat aber den Nachteil des unvorhersehbaren, zu niedrig Zelle Konzentrationen. Bulk-lyse der ZellenHinweis: Halten Sie die unmanipuliertes Proben horizontale RT, beim Fluss Cytrometric Erwerb am selben Tag durchgeführt werden kann, um den Vorgang am nächsten Tag starten. Aufschwemmen der Knochenmarkprobe Antikoagulanzien zur Homogenität durch die Probe mehrmals umdrehen. Die Konzentration von Knochenmarkzellen (Anzahl weißer Blutkörperchen (WBC)) mit einer Zelle zählen Kammer mit Zelle Tuerk Färbelösung zu bestimmen (siehe Tabelle der Materialien). Das benötigte Volumen des Knochenmarks in ein separates 15 mL Röhrchen pipettieren. Die Anzahl der Zellen ist abhängig von der Anzahl der separaten Färbung Röhren; Verwenden Sie für eine Färbung (ein Schlauch) ca. 2 x 106 weißen Blutkörperchen für die LAIP Messungen und 8 x 106 weißen Blutkörperchen zur Messung der LSC-Röhre. Lyse der roten Blutkörperchen durch Zugabe von Lysiereinrichtung Lösung (siehe Tabelle der Materialien). Erforderliche Menge Lyse Lösung sollte 10 Mal das Volumen der Zellsuspension. Mischen Sie, durch Umkehrung und 10 min bei RT inkubieren Zentrifugieren Sie für 7 min 800g bei RT verwerfen des Überstands (z. B. mit einer Vakuumpumpe oder Pasteurpipette). Aufschwemmen der Zelle Pellet in Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS)/0.05% azide-0.1% human Serumalbumin (HSA) (siehe Tabelle der Materialien) unter RT Anwendung die maximale Lautstärke des Rohres. Zentrifuge für 7 min 800g bei RT den überstand (z. B. mit einer Vakuumpumpe oder Pasteurpipette) zu verwerfen. Wieder die Zelle Pellet in PBS/0.05% azide-0.1% HSA zu einer Zelle Konzentration von 100 x 106 WBC/mL, und verteilen Sie über die Anzahl der vorgesehenen Rohre. Färbung von Zellen für die Durchflusszytometrie Pipettieren monoklonaler Antikörper (MoAb) cocktail Lösung mischen in die entsprechenden Fluoreszenz-activated Cell Sorter (FACS) Röhren und inkubieren Sie mit lysierten Knochenmarkzellen für 15 min in der Dunkelheit.Hinweis: Dies ist sehr wichtig, wenn Tandem-Farbstoffe verwendet werden. Beispielsweise sehen Sie die Mischungen der Paneele standardgemäß in unserem Labor (Tabelle S1) verwendet. Waschen Sie die Zellen mit 3 mL PBS/0.05% azide-0.1% hat. Zentrifugieren Sie die Zellen für 5 min bei 400g. Entsorgen Sie der Überstand (z. B. mit einer Vakuumpumpe oder Pasteurpipette) und das Aufschwemmen der Zelle Pellet in 300 µL PBS/0.05% azide-0.1%HSA. LSC-Messung: Aufschwemmen der Zelle Pellet in 400 µL PBS/0.05% azide-0.1% HSA und fügen Sie 4 µL leer Perlen (z.B. Spherotech, siehe Tabelle der Materialien) als Negativkontrolle Bevölkerung in der Analyse verwendet. Öffnen Sie die MRD oder LSC Experiment Lay-Out auf die FACS (siehe Tabelle der Materialien) und Maßnahme für MRD mindestens 100.000 WBC gated Ereignisse für die Messung von AML Patientenproben zur Diagnose und 1 X 106 WBC für AML-Proben bei der Nachuntersuchung. Für den LSC messen Experimente mindestens 4 x 106 WBC sowohl bei der Diagnose und Folgemaßnahmen für ein zuverlässiges Ergebnis des LSC. Speichern Sie die Daten mithilfe eines standardisierten entsprechenden Dateinamens für die Analyse der Ergebnisse. Machen Sie eine Bestandsaufnahme der verschiedenen gemessenen Marker auf der AML-Zellen und die AML-Stammzellen (positiv, negativ, über/unter Ausdruck) und speichern Sie diese Daten in das Laborjournal. Für den Fall, dass keine Diagnose LAIP verfügbar ist, Messen Sie alle 4 Röhren bei der Nachuntersuchung, um sicherzustellen, dass alle möglichen messbaren LAIP in einem unterschiedlichen aus Normal-Ansatz ermittelt werden kann. Wählen Sie die zuverlässigsten LAIP(s)13 bei der Diagnose festgestellt und erwerben so viele Veranstaltungen wie möglich, aber > Mindestzahlen definiert. 5. Identifizierung der Leukämie verbunden Immuno-Phänotypen (LAIP): Analyse der unterschiedlichen Zellpopulationen Hinweis: FCS-Dateien können mit mehreren Software-Programm für optimale Visualisierung der unterschiedlichen Zellpopulationen (siehe Tabelle der Materialien) analysiert werden. Weißen Blutkörperchen Bevölkerung Tor der CD45-positiven Zellen und die tragfähigen erscheinenden Zellen, niedrigen FSC (nicht-lebensfähige Zellen, erythroiden Zellen) innerhalb der FSC/SSC Handlung weglassen; Diese enthalten die WBC (Abbildung 3Aich). Zeigen Sie den WBC und verwenden Sie eine der primitiven Marker (z. B. CD34; Abbildung 3AIi) dazu beitragen, um die endgültige Position von den Anschlägen in de CD45dim Bereich (Abbildung 3AIii) zu ermitteln. Tor der CD45dim Zellen und wieder Tor die Zellen im FSC/SSC-Plot (Abb. 3 bich). Entfernen Sie das CD34-Tor (Abbildung 3Bii) beim melden % Zellen in dieses Tor als % Blasten im Stammbaum Bevölkerung im Programm. Zeigen Sie die Blasten im SSC/CD34 plot und gate-die CD34-positiven Zellen (Figure3Biii). Lymphozyten Verwenden Sie Lymphozyten als interne Kontrolle: myeloische Populationen als Negativkontrolle und lymphatischen Populationen als Positivkontrolle. Starten Sie von der weißen Blutkörperchen Bevölkerung (Abb. 4A). Tor-Lymphozyten als CD45hohe/SSCniedrige Bevölkerung (Abbildung 4 b). Stellen Sie sicher, dass es gibt keine myeloischen Zellen im Tor mit CD34, CD117, CD13 oder CD33 und Tor für die CD13 negativ/CD33 negative Zellen (Abbildung 4C-E). Rufen Sie diese Population “Lymphozyten” in der Bevölkerung-Struktur (Abb. 4F). LAIP zum Zeitpunkt der Diagnose Tor der Blasten und anschließend die CD34 positive Zellen in einem SSC/CD34 plot und nennen diese “primitive Marker” in der Struktur der Bevölkerung. Die primitive Zellen, in diesem Fall CD34-positiven und die Lymphozyten in ein neues Grundstück mit einem lymphatischen Marker (CD7) gegen ein myeloischer Marker (CD33) Grundstück. Tor der aberranten Bevölkerung (siehe Richtlinien zusätzliche Datei 1) und nennen sie “LAIP positiv” in der Struktur der Bevölkerung.Hinweis: Das Finale LAIP gewählt wird als % LAIP auf die Bevölkerung Explosion gemeldet. Die Sensitivität, Spezifität und Stabilität der den LAIP können nur von Fachpersonal mit langjähriger Erfahrung in MRD Messungen hergestellt werden. Die Summe dieser Parameter bestimmt die Qualität der LAIP. Beispiele für vier unterschiedliche LAIP Einschätzungen zum Zeitpunkt der Diagnose sind in Abbildung 5 A-Dangegeben. Bestimmen den Ausdruck der LAIP (% Blasten) und bewahren Sie diese Daten in einer Datenbank oder excel-Datei. Stellen Sie Berichte der FACS-Analysen und die Noten des LAIP, die bei MRD Messungen verwendet werden.Hinweis: Die Definition von LAIP ist berechtigt in einem Team von Experten da es ein wesentliches Merkmal für genaue Messungen der MRD zu folgen ist. MRD bei Follow-up Tor die Blasten wie in 5.1 jedoch je nach der Zeit nach der Therapie; richtige Einschätzung dieses Tores kann eine Herausforderung sein. Im Fokus des LAIP Phänotyps, der zum Zeitpunkt der Diagnose gegründet wurde und die unreife Bevölkerung Tor. Wie in 5.1 beschrieben. finden Sie das richtige Knaller-Tor basierend auf den definierten Aberrancy und Regeneration des Knochenmarks und normale Ausdrücke um sie Tor bewusst sein Wiederholen Sie das gleiche Anspritzung Strategie überhaupt Follow-up-Punkte und bestimmen Sie MRD als Prozentsatz der LAIP Zellen in der gesamten weißen Blutkörperchen Bevölkerung zu. Siehe zum Beispiel Abbildung 6A und 6 b. MRD-Positivität zu melden, wenn die % der MRD ≥ 0,1 % der weißen Blutkörperchen. Drucken Sie analysierte Daten in einem Standardformat, wöchentlich mit dem MRD-Team zu diskutieren. Registrieren Sie die Ergebnisse nach Konsens erreicht wird. Lassen Sie die Ergebnisse durch den Vorgesetzten genehmigt werden, bevor die Ärzte die Ergebnisse mitzuteilen. 6. Analyse der Stem cell MRD (LSC Single Tube)14 Analysen der LSC bei der Diagnose und Folgemaßnahmen Tor der Blasten, wie in Abschnitt 5.1 beschrieben. Als mögliche negative Kontrolle für CD38-Tor Erythrozyten-Anteil (d.h. verbleibenden Erythrozyten nach lyse, gekennzeichnet als SSCniedrige/FSCniedrig und CD45negativ). Falls erforderlich, können abgestorbene Zellen und Zellfragmente durch ein zusätzliches Tor in dieser Handlung ausgeschlossen werden. Bestimmen Sie innerhalb der leukämischen Explosion Tor der Subpopulation mit Ausdruck der CD34. Select innerhalb dieser Population die CD34+ CD38– Zellen (verwenden Sie als Cut-off: obere Grenze der leere Kalibrierung Perlen für Schwelle Bestimmung (siehe Tabelle der Materialien), der rot-Anteil oder Nutzung 103 als Cut-off Point). Rufen diese Population “CD38niedrigen Stammväter” (Abbildung 7).Hinweis: Siehe ergänzende Datei 1 Näheres über die Einstellung der CD38-cut-off-Ebenen. Bestimmen innerhalb dieser CD38geringe Bevölkerungsdichte der wahre CD34 + CD38sehr niedrig Stammzell-Bevölkerung, mit dem Median der roten Fraktion, den unteren Rand der leeren Kalibrierung Perlen oder wählen Sie 102 als Cut-off Point (Abbildung 7 ). Siehe zusätzliche Datei 1 weitere Informationen zur Festlegung der CD38-cut-off. Innerhalb beider Völker Tor der leukämischen Stammzellen vs. normale hämatopoetischen Stammzellen (LSC gegen HSC) durch die Analyse von einzelnen leukämischen Marker in der Systemsteuerung zur Verfügung gestellt (d.h. CD45RA, Combi-6 (CLEC12A, TIM-3, CD7, CD11b, CD22 und CD56 alles in PE), CD123, CD33 und CD44). Plot-Stammzell-Marker von Interesse im Vergleich zu anderen Stammzell-Marker, Positivität/Negativität mit Positivität/Negativität von anderen Markern zu vergleichen und um LSC gegen HSC Frequenz zu optimieren. Den Anteil der unreifen Blasten, Lymphozyten, CD34 + Zellen zu melden. Listen Sie für alle separaten Marker die Gesamtzahl der CD38niedrig und CD38Verylow und die Anzahl von CD38niedrig und CD38Verylow die Marker positiv (und damit neoplastischen) sind. Wählen Sie den Marker unterscheidet, die am besten normale Blutstammzellen vs. leukämischen Stammzellen zur weiteren Analyse. Berechnen Sie den Prozentsatz der LSC und HSC als Prozentsatz der gesamten WBC.Hinweis: Ein Prozentsatz des LSC ≥ 0,004 % wird als LSC positiv bei der Diagnose, während der Cut-off 0,0001 % bei Follow-up berichtet. Aberrante Stammzellen Anspritzung im Follow-up-Proben ist ähnlich wie Analyse, wie zum Zeitpunkt der Diagnose, aber Zellzahlen in der Stammzell-Populationen sehr klein sein können. Daher die Notwendigkeit des Erwerbs von genügend Ereignisse.