Protocolo abrangente de amostra e da medula óssea do processo de medição de doença Residual mensurável e células leucêmicas em leucemia mieloide aguda

O protocolo segue as diretrizes do código de pesquisa e o Comitê de ética de pesquisa da VU University Medical Center. 1. medula óssea aspiração e amostra preparação Preparação do paciente e material Preencha uma ou duas seringas de 10 mL com lidocaína a 1% usando uma agulha de calibre 16. Substitua a agulha por uma agulha de calibre 21. Coloque duas gotas de EDTA 5% em um vidro de relógio. Instituído em lâminas de vidro (n = 15 com numeração paciente consistente e data) para a preparação do esfregaço. Colocar o paciente em posição de decúbito lateral. Localize a espinha ilíaca posterior superior e marque com caneta.Nota: em geral, a espinha ilíaca superior posterior está localizada uma mão largura distal para a crista ilíaca e a lateral de largura de uma mão à sua mediana. Nas fêmeas, a coluna vertebral real pode ser um pouco mais lateral, em alguns homens um pouco mais medial. Desinfectar a pele com clorexidina 0,5-1% em etanol a partir da área de biopsia pretendido para o exterior em círculos. Abra o pacote de luvas esterilizadas, colocar as luvas estéreis e deitar o pacote sobre a mesa para criar um campo estéril. Abra o pacote com a agulha de aspiração e coloque-a sobre o campo estéril. Infiltre a pele e tecido subcutâneo e, finalmente, periósteo. No periósteo, administre a lidocaína de tal forma que uma área de 1 cm de diâmetro tem sido anestesiada.Nota: A administração adequada de lidocaína para o periósteo é um dos fatores mais importantes para o conforto do paciente. Testar se o periósteo tem sido devidamente anestesiado tocando o local de biopsia pretendido com a agulha introduzida e perguntar se o paciente sente dor. Nota: as crianças são totalmente anestesiadas durante todo o processo. Segure a agulha de aspiração (15 Ga x 2,8″) com a extremidade proximal na palma e dedo indicador contra o lado do eixo do metal a agulha perto da ponta; Esta posição permite melhor controle. Introduzir a agulha com um movimento rotativo (alternando rapidamente movimento pronating/supinação) através da pele em direção a espinha ilíaca e trazer a agulha em contacto com a espinha ilíaca posterior. Certifique-se que é de agulha é introduzida à área anestesiada do periósteo; o paciente deve sentir apenas pressão e sem dor. Se o paciente sente dor, reposicionar a agulha ou administrar lidocaína mais. Usando uma pressão suave mas firme, fazer avança a agulha enquanto girando-a alternadamente contador no sentido horário no sentido horário. Entrada na cavidade de medula geralmente é detectada por diminuição da resistência. Retire o estilete da agulha. Anexe uma seringa de 10 mL vazia para a agulha. Aplique pressão negativa ao retirar o êmbolo da seringa com uma tração suave. Avise o paciente que pode sentir uma sensação de cólicas e dor quando a medula está sendo aspirada. Se não é suficiente espículas de medula óssea são liberadas, outra aspiração deve ser realizada com um empate rápido. A maioria das espículas será no primeiro 1-2 mL obtido a atração inicial. Aspire somente 1-2 mL para evitar a diluição da amostra.Nota: Diluição resultará na hemodiluição e podem confundir MRD resultados). Remova a seringa e substituir o estilete para a agulha de aspiração. Ejete a parte da medula em um vidro de relógio e o resto em um tubo de 8 mL revestido com heparina.Nota: Inverta cada tubo imediatamente após a colocação do aspirado de medula para o tubo de amostra para garantir a anticoagulação adequada. Coagulação de medula óssea é frequentemente a causa de material impróprio. Adicionais da medula óssea pode ser aspirada do mesmo lugar, mas de preferência, a agulha é avançada 5-10 milímetros antes da tomada de um aspirado de novo. De preferência não mais de 2 sorteios por nível de inserção devem ser tomados. Certifique-se de marcar os tubos com aumento do número que representa o primeiro, segundo e/ou consecutivos empates. É a regra comum de usar o primeiro sorteio para a análise de diagnóstica mais relevante. Alternativamente, retirar a agulha do local de inserção e reintroduzi-lo na cavidade de medula alguns milímetros longe do lugar de inserção original e repita o procedimento.Nota: Não aspire a mais de 1-2 mL por tração, para evitar a contaminação de sangue significativo. Repita sempre que material é necessário. Quando o material suficiente para o protocolo do estudo clínico específico é aspirado, retire a agulha de medula óssea.Nota: No caso de aspirações da medula óssea lenta ou caso contrário difícil a utilização de seringas que foram previamente corada com anticoagulante pode ser útil. No caso de um toque seco, realize uma biópsia trefina que está fora do escopo deste manuscrito. Preparação de esfregaços para análise morfológica Para melhor avaliação morfológica, escolher espículas (por exemplo, usando uma espátula de plástico) do aspirado no vidro de relógio e coloque-os em uma lâmina de vidro. Delicadamente, coloque outra lâmina de vidro sobre o slide com a medula e deslize suavemente; Evite qualquer pressão.Nota: Somente em caso de grande medula óssea espículas ligeira pode exercer pressão, para diminuir a espessura da difusão celular. Os benefícios do procedimento de ajuda de um assistente que pode lidar com os tubos de amostra. Rotulagem exacta dos tubos com o paciente número e número do sorteio sequencial da medula óssea é crucial. Seque o slide e então executar Grünwald de Giemsa pode manchar (ver tabela de materiais). Examinar ao microscópio de luz para morfologia (ver Figura 1).Nota: A figura 1A mostra as manchas de saudáveis da medula óssea, consistindo de tipos diferentes de célula funcional enquanto figura 1B um paciente de LMA com explosões predominantemente leucêmicas. Para melhor definir a carga residual leucêmicas, immunophenotyping precisa ser executada. 2. o transporte de materiais para posterior processamento Preparação das amostras para transporte A fim de certificar-se que o material não irá vazar, e os tubos não quebrará, certifique-se de embalagem correta (ver Figura 2).Nota: De nossa e outras experiências a viabilidade das células é melhor preservada quando a medula óssea é mantida à temperatura ambiente. Para o transporte a longo prazo isso melhor é conseguido usando uma temperatura ‘bloco do gel’ para ajudar na estabilidade de temperatura durante o transporte. Rótulo de pacotes e adicionar as formas corretas para evitar a perda do pacote, transporte prolongado ou comutação dos pacientes.Nota: Isto deve conter, no mínimo: dados do paciente (formulário 1). Isto deve incluir o número do estudo e comumente a ‘data de nascimento’. Essencial para o processamento de certo do material após a chegada no laboratório receptora, é uma afirmação clara das especificamente análises laboratoriais solicitados (diagnóstico molecular, immunophenotyping, MRD etc) neste formulário. (Formulário 2) Endereço e número de telefone da pessoa a contactar, e quando necessário, os documentos para a alfândega. Para evitar a perda de pacotes pelo correio, o envio de laboratório sempre notifica o laboratório de recebimento foi enviada uma amostra. Recomenda-se o uso de “rastrear- e”. Receber amostras de outros institutos Certifique-se que a logística apropriada está em vigor no Instituto para receber a amostra ao laboratório assim que é entregue no Instituto.Nota: Para organização logística ideal de preferência um laboratório central é necessária, que recebe e coleta todo o material da clínica local e externo hospitais. Em particular, atribuir os protocolos para a distribuição e a comunicação clara com os laboratórios executivos é essencial. Depois de receber as amostras, com precisão, observe a numeração apropriada em formas de cópia e um banco de dados protegido, contendo campos importantes tais como o número de ID de MRD, número de identificação específico de julgamento, número de registro do Hospital, Instituto de envio, data de nascimento, material tipo (medula óssea ou sangue periférico), contagem de glóbulos brancos (WBC), data de aspiração de medula óssea, data da medição da amostra e quaisquer observações relevantes para a qualidade da medição.Nota: De preferência, esse banco de dados também é equipado para conter dados adicionais (ou estar ligado a outros bancos de dados) dos resultados de análise e mais dados do paciente como follow-up de dados. 3. instalação de citômetro de fluxo Nota: Esta seção baseia-se na Euroflow instruções. 11 Inicia-se a tensões fotomultiplicador (PMT) para parâmetros de FCS SSC e canais de fluorescência de alvo Parâmetros para o FCS SSC iniciar o citômetro de fluxo e executar o “citômetro de configuração e monitoramento (CST)” executar no citômetro de fluxo com grânulos de CST (ver tabela de materiais). Lise células vermelhas do sangue de um doador saudável (descrito na seção 4.1). Criar uma nova experiência (no menu: experiência, experiência nova, selecione o ensaio em branco) utilizando o software do fabricante (ver tabela de materiais) com uma dispersão para a frente (FSC) contra lateralmente (SSC) ponto de dispersão para configurar os parâmetros FSC e SSC. O nome desta experiência FSC/SCC PMT, com a data. Primeiro, use as configurações atuais de citômetro (clique direito: “aplicar CST atual”). Essas configurações foram geradas com a verificação de desempenho de CST usando grânulos CST-calibração (ver tabela de materiais). Ajuste o FSC e SSC para visualizar os linfócitos em “configurações do experimento global”. Nota: em nosso citômetro de fluxo são 285 V e 400 V respectivamente. Riscar a compensação de”habilitar”: configurações do Inspector/instrumento/compensação. Para avaliar o tamanho das células (FSC) e granularidade (SSC) iniciar a medição sem rótulo lysed células de sangue periféricas pela função “adquirir as células”. Portão a linfócitos e ajustar/fine-sintonias FSC e SSC tensões para atingir os seguintes valores-alvo significa para a população de linfócitos fechado: FSC: 100.000 (gama 95.000-105.000); SSC: 15.000 (escala de 13.000-17.000). Adquirir e registrar dados medindo pelo menos 10.000 eventos. Verifique se a média FSC e SSC valores para linfócitos gated-alvo e reajuste se necessário. Para configurar a fluorescência alvo canais voltagens PGTO usam partículas de calibração de grânulos 8-pico do arco-íris (ver tabela de materiais). Crie uma nova experiência sobre o FACS para 7-picos. Criar uma planilha “Destino cruel fluorescente intensidade (IFM)” com todos os lotes do ponto necessário (n = 2; FSC contra SSC, FITC contra PE), histogramas (n = 8; um histograma para cada detector de fluorescência) e dados estatísticos que demonstram a referência a valores de pico (IFM e coeficiente de variação (CV)) para cada canal de fluorescência. Prepare-se recentemente uma solução contendo 1 gota (± 60 µ l) de grânulos de arco-íris em 1 mL de dH2O. suavemente vórtice para misturar as gotas em solução. Use as configurações de PGTO a tensões FSC/SSC de cima e começar a medir a fluorescência dos grânulos do arco-íris usando a função de “adquirir” (sem gravação) em “Baixa” taxa de fluxo com um limite de 5.000. Use o botão”portão retangular” para portão a população de grânulos de singlete P1 no FSC contra trama do ponto do SSC. Portão 7th pico – população P2 no FITC contra trama do ponto do PE. Continue a aquisição das 7-picos do arco-íris do grânulo suspensão e ajustar/fine-sintonias PGTO tensões em todos os canais de fluorescência para alcançar os valores de acordo com os canais de destino anotados IFM IFM destino em conformidade com os grânulos. Usar o “Record” para coletar dados de cerca de 10.000 eventos e verifique o IFM para as 7th grânulos de pico. Se necessário, corrigi as tensões de pgto. Uma vez valores alvo IFM para o pico deth 7 são alcançados, registro/sobrescrever o arquivo para os valores finais de pgto. Salvar os valores finais de PGTO e nomeie o arquivo de instalação de PGTO com a data, que será salvar no catálogo de software do fabricante. Use esta configuração de PGTO para corrigir o vazamento sobre cada tintura de fluorescência. Configurações de compensação de fluorescência Rotular um tubo para o controle imaculado e cada anticorpo conjugado fluorocromo (ver tabela S1 para os fluorochromes usados). Pipete 100 µ l de buffer para cada tubo. Vórtice do frasco de grânulos de compensação multicolor (ver tabela de materiais) completamente e em seguida, adicione 1 gota cheia (± 60 µ l) destes grânulos para cada tubo.Nota: Evite pingar os grânulos ao lado do tubo ao adicioná-los a cada tubo. Isto pode levar a uma concentração baixa do grânulo e poderia impactar os resultados da matriz de compensação. Pipetar o volume apropriado calculado para um teste de anticorpos conjugados a fluorocromo suficiente (o que seria suficiente para manchar 106 células) no tubo correspondente e vórtice completamente. Não adicione anticorpo ao tubo controle imaculado. Incube durante 15 a 30 min no escuro à temperatura ambiente (RT). Adicionar 4 mL de tampão de lavagem (tampão fosfato salino (PBS)/0.05% azide-0.1% albumina de soro humano (HSA) (ver tabela de materiais)) para cada tubo. Centrifuga os tubos a 300g por 10 min. Retire o sobrenadante e ressuspender o grânulo pela adição de 0,2 mL de tampão de lavagem a cada tubo. Vórtice os tubos completamente. Abra o software de análise do fabricante (ver tabela de materiais) e criar uma nova experiência (no menu: experiência, experiência nova, selecione o ensaio em branco) e renomeie como arquivo de compensação com a data atual. Vá para “configurações de citômetro” e usar a configuração de PGTO da seção 3.1. Certifique-se de que o limiar de FSC é 5.000 e os valores de compensação de todos os fluorochromes usados são zero. Crie controles de compensação, incluindo tubos de rótulo específico, conforme necessário. Não se esqueça de incluir um controle imaculado. Selecione no menu: experimento, configuração de compensação, criar controles de compensação. Carregar o tubo controle imaculado e ajustar o portal P1 em torno da população de grânulo de singlete e certifique-se de que o portal P1 contém apenas contas de singlet. O portão de P1 com o botão direito e selecione “Aplicar para todos os controles da compensação”. Dados do registro para todos os tubos de fluorescência rotulado único. Verifique se que o P2 portão engloba a população positiva em cada histograma de fluorescência. Se for necessário ajustar o portão. Calcule a compensação. Selecione experimento, configuração de compensação, calcular a compensação. Se o cálculo da compensação não for bem-sucedida, exibe uma mensagem de erro. Faça os ajustes necessários e recalcular. Quando o cálculo da compensação é bem-sucedida, uma caixa de diálogo aparece arquivos de prompt para o nome para a configuração de compensação. Digite um nome (por exemplo instalação de cor de 8 aa-MM-DD) e clique, link e salvar. A configuração de compensação também será salvo ao catálogo da instalação de compensação.Nota: As mesmas configurações podem ser usadas para todos os experimentos usando a mesma fluorophores. 4. fluxo Cytometry avaliação (LAIP e LSC) Nota: Aqui descrevemos o processo de Lise em massa antes de coloração, que permite uma concentração preferencial de WBC de manchar. A maioria dos protocolos MRD usam essa abordagem, embora alguns usaram com sucesso outras opções como coloração antes de Lise. Toda medula óssea coloração antes lise minimiza a perda de célula preferencial12, mas tem a desvantagem de concentrações de célula imprevisível, muito baixo. Lise em massa de célulasNota: Manter as amostras unmanipulated horizontal no RT, quando a aquisição de cytrometric de fluxo não pode ser executada no mesmo dia, a fim de iniciar todo o procedimento no dia seguinte. Resuspenda da amostra de medula óssea anticoagulados a homogeneidade da amostra várias vezes por inversão. Determinar a concentração de células da medula óssea (contagem de glóbulos brancos (WBC)) usando uma célula de contagem câmara com célula coloração Tuerk solução (veja a tabela de materiais). Pipetar o volume necessário de medula óssea em um tubo de 15ml separado. A quantidade de células é dependente do número de tubos de coloração distintos; para uma coloração (um tubo) use aproximadamente 2 x 106 células brancas do sangue para as medições LAIP e 8 x 106 células brancas do sangue para a medição do tubo da LSC. Lyse pilhas de sangue vermelhas, adicionando solução de lise (ver tabela de materiais). Volume necessário de solução de Lise deve ser 10 vezes o volume da suspensão celular. Misture delicadamente, por inversão e incubar durante 10 minutos a RT Centrifugar durante 7 min 800g em RT. descartar o sobrenadante (por exemplo, com uma bomba de vácuo ou pipeta Pasteur). Ressuspender as células em tampão fosfato salino (PBS)/0.05% azide-0.1% albumina de soro humano (HSA) (ver tabela de materiais) para uso de RT. o volume máximo do tubo. Centrífuga para 7 min 800g em RT. descartar o sobrenadante (por exemplo, com uma bomba de vácuo ou pipeta Pasteur). Ressuspender o sedimento celular em PBS/0.05% azide-0.1% HSA para uma concentração de célula de 100 x 106 WBC/mL e divida sobre o número de tubos pretendidos. Coloração de células por citometria de fluxo Pipeta anticorpo monoclonal (MoAb) solução cocktail mistura para os tubos de classificador (FACS) célula apropriada de fluorescência-ativado e incubar com as células de medula lisados por 15 min no escuro.Nota: Isto é muito importante quando são utilizados em tandem-corantes. Por exemplo, ver as misturas dos painéis canonicamente utilizados em nosso laboratório (tabela S1). Lavar as células com 3ml PBS/0.05% azide-0.1% tem. Centrifugar as células durante 5 min à 400g. Descarte o sobrenadante (por exemplo, com uma bomba de vácuo ou pipeta Pasteur) e o Ressuspender o pellet de células em 300 µ l PBS/0.05% azide-0.1%HSA. Para medição de LSC: Ressuspender as células em 400 µ l PBS/0.05% azide-0.1% HSA e adicione 4 µ l de grânulos em branco (por exemplo, Spherotech, consulte a tabela de materiais) para usar como população controlo negativo na análise. Abra MRD ou LSC experimento lay-out sobre o FACS (ver tabela de materiais) e medida para MRD pelo menos 100.000 WBC gated eventos para medição de amostras de pacientes LMA no diagnóstico e 1 X 106 WBC para amostras de LMA no seguimento. Para a LSC experimentos medem pelo menos 4 x 106 WBC tanto no diagnóstico e acompanhamento para um resultado confiável do LSC. Salve os dados usando um nome de arquivo apropriado padronizada para a análise dos resultados. Fazer um inventário dos diferentes marcadores medidos sobre as células da LMA e sobre as células-tronco AML (positivo, negativo, sobre/sob a expressão) e armazenar esses dados no jornal laboratório. Caso não haja nenhum diagnóstico LAIP disponível, medir todos os 4 tubos em acompanhamento para garantir que qualquer possível LAIP mensurável pode ser identificado através de uma abordagem diferente da normal. Escolha o mais confiável LAIP(s)13 estabelecida no momento do diagnóstico e adquirir tantos eventos quanto possível, mas > números mínimos definidos. 5. identificação de imuno-fenótipos associados leucemia (LAIP): análises de populações de células diferentes Nota: Arquivos FCS podem ser analisados com vários programa de software para visualização ideal das populações de célula diferente (ver tabela de materiais). População de células brancas do sangue Portão as CD45 de células positivas e as células viáveis aparecendo, deixando de fora o baixo FSC (células não-viáveis, eritroide células) dentro da parcela FSC/CCD; Estes contêm o WBC (Figura 3Aeu). Mostrar o WBC e usar um dos marcadores primitivos (por exemplo CD34; Figura 3Aii) para ajudar a determinar a posição final de explosões na área de CD45dim (Figura 3Aiii). As células CD45dim da porta e portão volta as células na trama do FSC/SSC (Figura 3Beu). Remova o portão CD34 (Figura 3Bii) ao relatar as células % este portão como % de blastos na sua árvore de população no programa. Mostre as explosões em um SSC/CD34 plotagem e portão de células CD34 positivas (Figure3Biii). Linfócitos Use os linfócitos como um controle interno: mieloides populações como populações linfoides como um controle positivo e um controle negativo. Iniciar a partir da população de células brancas do sangue (Figura 4A). Linfócitos de portão como CD45alta/SSCbaixa população (Figura 4B). Certifique-se que existem sem pilhas myeloid na porta usando o CD34, CD117, CD13 ou CD33 e portão para as células negativas de negativo/CD33 CD13 (Figura 4C-E). Chame essa população ‘linfócitos’ na árvore de população (Figura 4F). LAIP no momento do diagnóstico Portão a explosões e posteriormente as células CD34 positivas um SSC/CD34 plotagem e chamam esses marcador’ primitivo’ na árvore de população. Plotar as células primitivas, neste caso CD34 positivo e os linfócitos em um novo enredo com um marcador linfoide (CD7) contra um marcador mieloide (CD33). Portão a população aberrante (ver orientações complementares 1 arquivo) e chamá-los ‘LAIP positivo’ na árvore de população.Nota: O final escolhido LAIP é relatado como % LAIP sobre a população de explosão. A sensibilidade, especificidade e estabilidade dos LAIPs podem ser estabelecidas apenas por pessoal com ampla experiência em medições de MRD. O total desses parâmetros determina a qualidade do Roberto. Exemplos de quatro diferentes avaliações de LAIP no diagnóstico são dadas na Figura 5 A-D. Determinar a expressão de LAIPs (% de blastos) e preservar esses dados em um banco de dados ou arquivo excel. Fazer relatórios das análises FACS e as notas de LAIPs que devem ser utilizados em medições de MRD.Nota: A definição de LAIPs é autorizada em uma equipe de especialistas desde que é uma característica essencial para medições precisas de MRD no siga. MRD no acompanhamento Portão a explosões, conforme descrito em 5.1, mas dependendo do ponto de tempo após a terapia; correta avaliação deste portão pode ser um desafio. Focar o fenótipo LAIP foi estabelecida no momento do diagnóstico e portão a população imatura. Conforme descrito em 5.1. encontrar a porta correta explosão baseia o aberrancy definido e estar ciente de regenerar a medula óssea e expressões normais para eles para fora da porta Repita a mesma estratégia de retenção de acompanhamento em todos os pontos e determinar MRD como a percentagem de células LAIP na população de células brancas do sangue inteiro. Consulte exemplos figura 6A e 6B. Relatório de positividade MRD quando a % de MRD é ≥ 0,1% de células brancas do sangue. Imprima dados analisados em um formato padrão para discutir semanalmente com a equipe MRD. Registre os resultados depois de consenso. Deixe os resultados a ser autorizado pelo supervisor antes de comunicar os resultados para os clínicos. 6. análise de tronco célula MRD (LSC tubo único)14 Análises da LSC no diagnóstico e acompanhamento Portão os blastos, conforme descrito na seção 5.1. Como controle negativo potencial do CD38-, portão eritrócitos-fração (ou seja, restantes células vermelhas do sangue após a Lise, caracterizado como SSCbaixa/FSCbaixa e CD45negativo). Se necessário, as células mortas e fragmentos de células podem ser excluídos por um portão extra nesta trama. Determine dentro do portão de explosão leucêmicas a subpopulação com expressão de CD34. Selecione dentro desta população o CD34+ CD38 células– (usar como Cut-off: borda superior dos grânulos calibração em branco para determinação do limiar (ver tabela de materiais), o vermelho-fração ou uso 103 como ponto de corte). Chamar essa população ‘CD38 progenitoresbaixo’ (Figura 7).Nota: Ver arquivo complementar 1 para mais detalhes sobre a configuração dos níveis de CD38-corte-off. Determinar dentro desta populaçãobaixa CD38 populacional células-troncomuito baixa o verdadeiro CD34 + CD38, usando a mediana da fração vermelha, a borda inferior dos grânulos calibração em branco ou escolher 102 como ponto de corte (Figura 7 ). Ver arquivo complementar 1 para mais detalhes sobre como definir os níveis de CD38-corte-off. Dentro de ambas as populações, portão as células leucêmicas vs as células-tronco hematopoiéticas normais (LSC versus HSC) analisando cada marcador leucêmicas fornecido no painel (ou seja, CD45RA, combi-6 (CLEC12A, TIM-3, CD7, CD11b, CD22 e CD56 tudo em PE), CD123, CD33 e CD44). Marcador de células-tronco de interesse contra outro marcador de células-tronco para comparar com a negatividade/positividade de outros marcadores da positividade/negatividade e ajustar LSC versus frequência HSC de plotagem. Apresente-se a porcentagem de blastos imaturos, linfócitos, células CD34 +. Para marcadores todos separados, liste os números totais de CD38baixa e CD38verylow e os números debaixo CD38 e CD38verylow que são marcador positivo (e, portanto, neoplásica). Selecione para o marcador que melhor distingue as células-tronco hematopoiéticas normais vs células leucêmicas para uma análise mais aprofundada. Calcule a percentagem de LSC e HSC como porcentagem do total WBC.Nota: Uma percentagem do LSC de ≥ 0,004% é relatada como LSC positiva no momento do diagnóstico, enquanto o limite é de 0,0001% no seguimento. Células-tronco aberrantes gating em amostras de acompanhamento é semelhante a análise como no momento do diagnóstico, no entanto, números de telemóvel nas populações de células-tronco podem ser muito pequenos. Daí a necessidade de adquirir suficiente eventos.