Uitgebreide Protocol bij monster en proces beenmerg voor het meten van meetbare residuele ziekte en leukemische cellen van de stam in Acute myeloïde leukemie

Het protocol volgt de richtlijnen van de code van het onderzoek en de ethische commissie van onderzoek van het VU medisch centrum. 1. het beenmerg aspiratie en sample voorbereiding Voorbereiding van de patiënt en materiële Vul één of twee 10 mL spuiten met 1% lidocaïne met behulp van een naald 16-gauge. Vervang de naald voor een 21-gauge naald. Doe twee druppels van 5% EDTA op een horlogeglas. Instellen van glas dia’s (n = 15 met consistente patiënt nummering en datum) voor de voorbereidingen van het uitstrijkje. Plaats patiënt in positie van de laterale decubitus. Zoek de superieure posterieure iliac wervelkolom en Markeer met een pen.Opmerking: In het algemeen, de achterste superieure iliac wervelkolom is gelegen enerzijds breedte distale op de iliacale crest en enerzijds breedte zijdelings aan de middellijn. Bij vrouwtjes kunnen de werkelijke wervelkolom een beetje meer laterale, bij sommige mannen een beetje meer mediale. Desinfecteren van de huid met chloorhexidine 0,5-1% in ethanol uit het beoogde biopsie gebied uiterlijke in cirkels. Open het pak van steriele handschoenen, zetten de steriele handschoenen en vast van het pakket op tafel om een steriele veld te maken. Openen van het pakket met de naald aspiratie en plaats deze op het steriel veld. De huid en de subcutane weefsel en ten slotte het beenvlies infiltreren. Beheren op het beenvlies, de lidocaïne op zodanige wijze dat een gebied van 1 cm diameter heeft zijn verdoofd.Opmerking: Adequate toediening van lidocaïne aan het beenvlies is een van de belangrijkste factoren voor het comfort van de patiënt. Test of het beenvlies heeft voldoende is verdoofd door te tikken op de beoogde biopsie locatie met de geïntroduceerde naald en vragen als de patiënt pijn voelt. Van de nota: kinderen zijn volledig verdoofd tijdens de hele procedure. Houd de naald van de aspirate (15 Ga x 2,8″) met het proximale eind in de palm en de wijsvinger tegen de zijkant van de metalen schacht van de naald in de buurt van de tip; deze positie geeft u beter controle. De naald met een roterende beweging introduceren (door snel wisselende pronating/supinating verkeer) door de huid naar de iliacale wervelkolom en breng de naald in contact met de achterste iliac wervelkolom. Dat wil zeggen zorgen naald wordt geïntroduceerd op de narcose gebied van het beenvlies; de patiënt moet alleen druk en geen pijn voelen. Als de patiënt pijn voelt, verplaatsen de naald of beheren van meer lidocaïne. Met behulp van zachte maar vastberaden druk, gaan de naald tijdens het draaien met een afwisselend met de klok mee-teller klok beweging. Entree in de holte van het beenmerg is over het algemeen herkend door verminderde weerstand. Verwijder de stilet uit de naald. Sluit een lege spuit van 10 mL aan op de naald. Negatieve druk uitoefenen door het intrekken van de zuiger van de spuit met een zachte trekken. Waarschuw de patiënt dat ze een kramp gevoel en pijn voelen kunnen wanneer beenmerg is wordt aanzuiging. Als niet genoeg botsplinters beenmerg worden vrijgegeven, moet een andere ambitie worden verricht met een snelle trekken. Meeste botsplinters zullen in de eerste 1-2 mL verkregen bij de eerste pull. Gecombineerd slechts 1-2 mL Voorkom verdunning van het monster.Opmerking: Verdunning zal resulteren in hemodilution en kan verwarren MRD resultaten). De spuit verwijderen en vervangen van de stilet in de naald aspiratie. Werpen deel van het beenmerg in een horlogeglas en de rest in een 8 mL-buis bedekt met heparine.Opmerking: Omkeren elke buis onmiddellijk na het plaatsen van het beenmerg-aspirate in de buis specimen om adequate antistolling. Het beenmerg coagulatie is vaak de oorzaak van ongepast materiaal. Extra beenmerg kan worden aanzuiging van dezelfde plek, maar de naald is bij voorkeur 5-10 mm gevorderd, voordat een nieuwe aspirate wordt genomen. Bij voorkeur moeten niet meer dan 2 trekt per invoeging niveau worden genomen. Zorg ervoor dat ter gelegenheid van de buizen met steeds meer vertegenwoordigt van het eerste, tweede en/of opeenvolgende trekt. Het is de gemeenschappelijke regel te gebruiken de eerste loting voor de meest relevante diagnostische analyse. U kunt ook intrekken van de naald van de plaats van de invoegpositie en het opnieuw in het beenmerg holte een paar millimeter afstand van de originele plaats van de invoegpositie en herhaal de procedure.Opmerking: Niet meer dan 1-2 mL per trekken, om belangrijke bloed verontreiniging te voorkomen gecombineerd. Zo vaak herhalen als materiaal nodig is. Verwijder de naald beenmerg wanneer voldoende materiaal voor de specifieke klinische studie protocol is aanzuiging.Opmerking: In geval van langzame of anders moeilijk beenmerg aspiraties het gebruik van injectienaalden die vooraf gespoeld met antistollingsmiddel waren nuttig kan zijn. In het geval van een droge kraan, een biopsie van de trephine die buiten de werkingssfeer van dit manuscript uit te voeren. Voorbereiding van uitstrijkjes voor morfologische onderzoek Voor optimale morfologische beoordeling, uitzoeken van botsplinters (bijvoorbeeld het gebruik van een plastic spatel) van de aspirate in de horloge-glas en leg ze op een glasplaatje. Voorzichtig plaats een glasplaatje boven de dia met het beenmerg en zachtjes schuif; Vermijd druk.Opmerking: Alleen in geval van zeer grote beenmerg botsplinters lichte druk kan worden uitgeoefend, te verminderen van de dikte van de verspreiding van de cel. De voordelen van de procedure van de hulp van een assistent die kan omgaan met de model-buizen. Nauwkeurige etikettering van de buisjes met de patiënt en aantal van de loting sequentiële beenmerg is cruciaal. Goed afdrogen van de dia, en vervolgens uit te voeren kan Giemsa Grünwald kleuring (zie tabel van materialen). Onderzoeken onder de lichte Microscoop voor morfologie (Zie Figuur 1).Opmerking: Figuur 1A blijkt de uitstrijkjes van gezond beenmerg, bestaande uit verschillende functionele celtypes terwijl figuur 1B een AML patiënt met overwegend leukemische ontploffing. Als u wilt beter definiëren de residuele leukemische last, hoeft immunophenotyping te worden uitgevoerd. 2. vervoer van materiaal voor verdere verwerking Bereiding van de monsters voor vervoer Om ervoor te zorgen dat het materiaal niet lekken zal en de buizen niet zal breken, zorg voor een juiste verpakking (Zie Figuur 2).Opmerking: Uit onze en anderen ervaringen de levensvatbaarheid van de cellen is best bewaard wanneer het beenmerg wordt bewaard bij kamertemperatuur. Voor het vervoer op lange termijn is dit best bereikt met behulp van een kamertemperatuur ‘gel-pack’ om hulp in stabiliteit van de temperatuur tijdens het vervoer. Label pakketten en het toevoegen van de juiste formulieren om verlies van het pakket, langdurige vervoer te voorkomen of het schakelen van patiënten.Opmerking: Dit moet ten minste bevatten: (formulier 1) patiëntgegevens. Dit moet het nummer van de studie en vaak de ‘geboortedatum’ bevatten. Essentieel voor de juiste verwerking van het materiaal na aankomst in het ontvangende laboratorium, is een duidelijke verklaring van de specifiek gevraagde laboratoriumanalyses (moleculaire diagnostiek, immunophenotyping, MRD etc.) op dit formulier. (Formulier 2) Adres en telefoon nummer van een contactpersoon, en wanneer nodig, documenten voor de douane. Voorkom verlies van pakketten in de mail, waarschuwt het verzendende laboratorium altijd de ontvangende lab dat een monster is verstuurd. Gebruik van “track and trace” wordt aanbevolen. Ontvangen van monsters van andere instituten Zorg ervoor dat de geschikte logistiek in plaats op het Instituut te ontvangen van het monster in het laboratorium, zodra het is afgeleverd aan het Instituut.Opmerking: Voor optimale logistieke organisatie bij voorkeur een centraal laboratorium vereist is, ontvangt die en verzamelt al het materiaal uit de lokale kliniek en externe ziekenhuizen. In het bijzonder, is het toekennen van protocollen voor distributie en duidelijke communicatie met de uitvoerende laboratoria essentieel. Na ontvangst van de monsters, opmerking nauwkeurig de juiste nummering in harde kopie vormen en een beveiligde database met belangrijke terreinen zoals MRD id-nummer, Trial specifieke id-nummer, registratienummer ziekenhuis, verzenden Instituut, datum van geboorte, materiaal type (beenmerg of perifere bloed), witte bloedcellen (WBC), datum van beenmerg aspiratie, datum van meting van het monster en eventuele opmerkingen die van belang voor de kwaliteit van de meting.Opmerking: Bij voorkeur deze database is ook uitgerust met aanvullende gegevens bevatten (of naar andere databases worden gekoppeld) van analyseresultaten, en verdere patiëntgegevens zoals follow-up gegevens. 3. flow Cytometer Setup Opmerking: Deze sectie is gebaseerd op Euroflow instructies. 11 Het instellen van fotomultiplicator (PMT) spanningen voor FCS SSC parameters en doel fluorescentie kanalen Voor de FCS-WS parameters de stroom cytometer opstarten en uitvoeren van de “Cytometer Setup en Tracking (CST)” uitvoeren op de cytometer van de stroom met CST kralen (zie tabel van materialen). Lyse van rode bloedcellen van een gezonde donor (beschreven in punt 4.1). Maak een nieuw experiment (In menu: Experiment, nieuwe experimenteren, selecteer lege experiment) met behulp van software van de fabrikant (zie tabel van materialen) met een Forward scatter (FSC) versus zijwaartse (SSC) stip scatterplot voor het instellen van de parameters FSC en WS. De naam van dit experiment FSC/SCC bet met de datum. De huidige instellingen van de cytometer voor het eerst gebruikt (Klik met de rechtermuisknop: “toepassing van de huidige CST”). Deze instellingen zijn gegenereerd met de CST prestaties controleren met behulp van CST-kalibratie kralen (zie tabel van materialen). FSC en SSC om te visualiseren de lymfocyten in “global experiment instellingen” aanpassen. Opmerking: in onze stroom cytometer deze zijn 285 V 400 V respectievelijk en. De “inschakelen compensatie” in afvinken: inspecteur/Instrument instellingen/compensatie. Om te beoordelen van de grootte van de cellen (FSC) en granulariteit (SSC) lysed start meten labelloze perifere bloedcellen door de functie “verwerven cellen”. Poort van de lymfocyten en aanpassen/fine-tune FSC en SSC spanningen te bereiken de volgende gemiddelde streefwaarden voor de gated lymfocyten bevolking: FSC: 100.000 (bereik 95.000-105.000); SSC: 15.000 (bereik 13.000-17.000). Verwerven en registreren van gegevens door het meten van ten minste 10.000 gebeurtenissen. Controleer of het gemiddelde FSC en WS streefwaarden voor gated lymfocyten en opnieuw aanpassen indien nodig. Voor de oprichting van de fluorescentie doel gebruiken kanalen bet spanningen 8-piek regenboog kralen kalibratie deeltjes (zie tabel van materialen). Maak een nieuw experiment op de FACS voor 7-pieken. Maak een werkblad “Target gemiddelde TL intensiteit (MFI)” met alle nodige dot percelen (n = 2; FSC versus SSC, FITC versus PE), histogrammen (n = 8; een histogram voor elke fluorescentiedetector) en statistieken waaruit de verwijzing piekwaarden (MFI en variatiecoëfficiënt (CV)) voor elk kanaal van de fluorescentie. Bereid vers een oplossing met 1 druppel (± 60 µL) van regenboog parels in 1 mL dH2O. zachtjes vortex te mengen de kralen in oplossing. Gebruik de instellingen van de bet van de FSC/SSC spanningen van bovenaf en start meten van de fluorescentie van de regenboog parels met behulp van de functie “verwerven” (zonder opnemen) op “Laag” debiet met een drempel van 5.000. Gebruik de “rechthoekig gate button” naar gate de singlet kralen bevolking P1 in de FSC versus SSC dot plot. Poort van de 7th PEAK – bevolking P2 in de FITC versus PE dot plot. Blijven de verwerving van de 7-peaks Rainbow kraal schorsing en aanpassen/fine-tune bet spanningen in alle kanalen van de fluorescentie te bereiken MFI streefwaarden volgens de geannoteerde MFI doel kanalen zoals bepaald met de kralen. “Record” gegevens van ongeveer 10.000 gebeurtenissen te verzamelen en controleren van de MFI voor de 7th gebruiken piek kralen. Corrigeer de bet spanningen indien nodig. Eenmaal Target MFI waarden voor de 7th piek bereikt, record/overschrijven van het bestand voor de resultaatwaarden van de bet. De laatste bet waarden opslaan en de naam van het bestand bet Setup met de datum, die zal worden opgeslagen in de catalogus van de software van de fabrikant. Gebruik deze bet setup voor het verhelpen van de lekkage voor elke kleurstof fluorescentie. Fluorescentie compensatie-instellingen Label van een buis voor de onbevlekt controle en elke fluorescerende geconjugeerd antilichaam (zie tabel S1 voor de gebruikte fluorochromes). Pipetteer 100 µL van buffer in elke buis. Vortex de flacon van multicolor compensatie parels (zie tabel van materialen) grondig en voeg vervolgens 1 volledige druppel (± 60 µL) van deze parels aan elke buis.Opmerking: Vermijd druipen van de parels langs de zijkant van de buis terwijl ze aan elke buis toe te voegen. Dit kan leiden tot lage kraal concentratie en de resultaten van de matrix met compensatie kon beïnvloeden. Pipetteer het juiste volume berekend voor een test van fluorescerende-geconjugeerde antilichaam voldoende (die zou voldoende zijn om vlek 106 cellen) in de overeenkomstige buis en vortex grondig. Voeg geen antilichaam aan de buis onbevlekt controle. Incubeer gedurende 15 tot 30 min in het donker bij kamertemperatuur (RT). Voeg 4 mL was buffer (met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)/0.05% azide-0.1% menselijke serumalbumine (HSA) (zie tabel van materialen)) aan elke buis. Centrifugeer de buizen bij 300g voor 10 min. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet kraal door 0,2 mL was buffer toe te voegen aan elke buis. Vortex de buizen grondig. Open software van de analyse van de fabrikant (zie tabel van materialen) en maak een nieuw experiment (In menu: Experiment, nieuwe experimenteren, selecteer lege experiment) en hernoemen als compensatie bestand met de huidige datum. Ga naar “cytometer instellingen” en de instelling van de bet van punt 3.1. Zorg ervoor dat de drempel in FSC 5.000 is en de waarden van de compensatie van alle gebruikte fluorochromes nul zijn. Compensatie besturingselementen, met inbegrip van label-specifieke buizen, zo nodig maken. Zorg ervoor dat een onbevlekt besturingselement opnemen. Selecteer uit het menu: Experiment, compensatie Setup, compensatie-besturingselementen maken. De buis onbevlekt besturingselement laden en aanpassen van de P1 poort rond de singlet kraal bevolking en zorgt ervoor dat de P1 poort alleen singlet kralen bevat. Met de rechtermuisknop op de P1 poort, en selecteer ‘Toepassen op alle compensatie Controls’. Registratie van de gegevens voor alle buizen van de enkele gelabelde fluorescentie. Controleer of dat P2 poort de positieve bevolking op elke fluorescentie-histogram omvat. Indien nodig aanpassen van de poort. De compensatie te berekenen. Selecteer Experiment, compensatie Setup, berekenen vergoeding. Als de berekening van de compensatie niet lukt, wordt er een foutbericht weergegeven. De nodige aanpassingen en herberekenen. Bij de berekening van de compensatie gelukt is, verschijnt een venster gevraagd naar de naam voor de setup van de compensatie. Voer een naam in (bijvoorbeeld YY-MM-DD 8 kleur instellingen) en klikt u op koppelen en opslaan. De compensatie setup zal ook de compensatie setup catalogus worden opgeslagen.Opmerking: Dezelfde instellingen kunnen worden gebruikt voor alle experimenten met behulp van de dezelfde fluorophores. 4. Stroom Cytometry beoordeling (LAIP en LSC) Opmerking: Hier beschrijven we de bulk lysis van de procedure voor de kleuring, die het mogelijk maakt om een gewenste concentratie van WBC vlek. Meeste MRD protocollen gebruikt deze aanpak, hoewel sommige met succes andere opties gebruikt heb zoals kleuring voor lysis. Hele beenmerg kleuring voor lysis minimaliseert preferentiële cel verlies12, maar heeft het nadeel van onvoorspelbare cellen met een te lage concentraties. Lysis van de bulk van cellenOpmerking: Houd de unmanipulated monsters horizontale op RT, wanneer stroom cytrometric overname kan niet worden uitgevoerd dezelfde dag om te beginnen de hele procedure de volgende dag. Resuspendeer aan homogeniteit vertonen beenmerg monster door het monster meerdere malen omkeren. Bepaal de concentratie van beenmergcellen (witte bloedcellen (WBC)) met behulp van een cel tellen kamer met cel Tuerk kleurstofoplossing (zie tabel van materialen). Pipetteer het benodigde volume van het beenmerg in een aparte 15 mL-buis. Het bedrag van de cellen is afhankelijk van het aantal afzonderlijke kleuring buizen; gebruik ongeveer 2 x 106 witte bloedcellen voor de LAIP metingen en 8 x 106 witte bloedcellen voor meting van de LSC buis voor een kleuring (één buis). Lyse van rode bloedcellen door lysing oplossing toe te voegen (zie tabel van materialen). Vereiste hoeveelheid lysing oplossing moet 10 maal het volume van de celsuspensie. Meng voorzichtig, door inversie en incubeer gedurende 10 min op RT. Centrifugeer gedurende 7 min 800g bij RT. Discard het supernatant (bijv. met een vacuümpomp of een pipet van Pasteur). Resuspendeer de pellet cel in een met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)/0.05% azide-0.1% menselijke serumalbumine (HSA) (zie tabel van materialen) op RT. gebruik het maximale volume van de buis. Centrifugeer gedurende 7 min 800g bij RT. Verwijder het supernatant (bijv. met een vacuümpomp of een pipet van Pasteur). Resuspendeer de pellet cel in PBS/0.05% azide-0.1% HSA tot een concentratie van de cel van 100 x 106 WBC/mL, en verdeel over het aantal beoogde buisjes. Kleuring van cellen voor stroom cytometry Pipetteer monoklonaal antilichaam (MoAb) cocktail oplossing mengen in de gewenste cel van de fluorescentie-geactiveerde sorter (FACS) buizen en incubeer met het beenmerg lysed cellen gedurende 15 min. in het donker.Opmerking: Dit is zeer belangrijk wanneer tandem-kleurstoffen worden gebruikt. Zie bijvoorbeeld de mengelingen van de panelen bij die gebruikt worden in ons laboratorium (tabel S1). Wash de cellen met 3 mL PBS/0.05% azide-0.1% heeft. De cellen gedurende 5 minuten bij 400gcentrifugeren. Het supernatant (bijv. met een vacuümpomp of een pipet van Pasteur) en de resuspendeer de pellet cel in 300 µL PBS/0.05% azide-0.1%HSA te negeren. Voor de meting van de LSC: resuspendeer de pellet cel in 400 µL PBS/0.05% azide-0.1% HSA en voeg 4 µL van lege parels (b.v. Spherotech, zie tabel van materialen) gebruiken als negatieve controle bevolking in de analyse. Open de MRD of LSC experiment lay-out op de FACS (zie tabel van materialen) en maatregel voor MRD ten minste 100.000 WBC gated gebeurtenissen voor meting van de patiënt monsters AML bij diagnose en 1 X 106 WBC voor AML monsters bij follow-up. Experimenten maatregel voor de LSC ten minste 4 x 106 WBC zowel bij de diagnose en opvolging voor een betrouwbare LSC resultaat. Sla de gegevens met behulp van een gestandaardiseerde juiste bestandsnaam voor de analyse van de resultaten. Maak een inventaris van de verschillende gemeten markers op de AML-cellen en op de AML stamcellen (positief, negatief, over/onder expressie) en slaat deze gegevens op in het lab dagboek. In het geval er geen diagnose LAIP beschikbaar, meten alle 4 buizen bij follow-up om ervoor te zorgen dat elk mogelijk meetbare LAIP in een verschillende-van-normale benadering kan worden geïdentificeerd. Kies de meest betrouwbare LAIP(s)-13 op diagnose vastgesteld en het verwerven van zo vele evenementen mogelijk, maar > min. aantallen gedefinieerd. 5. identificatie van leukemie verbonden Immuno-fenotypes (LAIP): Analyses van verschillende cel populaties Opmerking: FCS bestanden kunnen worden geanalyseerd met verschillende softwareprogramma voor optimale visualisatie van de andere cel populaties (zie tabel van materialen). White blood cell bevolking Poort van de CD45 positieve cellen en de levensvatbare verschijnen cellen, weglaten van lage FSC (niet-levensvatbare cellen, erythroid cellen) binnen de FSC/SSC plot; Deze bevatten de WBC (figuur 3Aik). Toon de WBC en gebruik een van de primitieve markers (bijvoorbeeld. CD34; Figuur 3Aii) om te helpen om na te gaan van het definitieve standpunt van de ontploffing in de CD45dim gebied (figuur 3Aiii). Poort van de CD45dim cellen en terug de poort van de cellen in de FSC/SSC-plot (figuur 3Bik). Verwijder de CD34 poort (figuur 3Bii) terwijl de rapportage van de cellen van de % in deze poort als % ontploffing in uw structuur van de bevolking in het programma. Toon de ontploffingen in een SSC/CD34 plot en poort van de positieve cellen van CD34 (Figure3Biii). Lymfocyten Lymfocyten gebruiken als een interne controle: myeloïde populaties als een negatieve controle en lymfoïde populaties als positieve controle. Starten vanuit de bevolking van de witte bloedcel (figuur 4A). Gate lymfocyten als de CD45hoge/SSClage bevolking (figuur 4B). Zorg ervoor dat er geen myeloïde cellen in de poort met behulp van CD34, CD117, CD13 of CD33 en poort voor de CD13 negatief/CD33 negatieve cellen (Figuur 4C-E). Bel me over deze populatie ‘lymfocyten’ de bevolking boom (figuur 4F). LAIP tot diagnose Poort van de ontploffingen en vervolgens de CD34 positieve cellen in een SSC/CD34 plot en noemen deze ‘primitieve marker’ in de structuur van de bevolking. De primitieve cellen, in dit geval CD34 positief, en de lymfocyten in een nieuwe plot plot met een lymfoïde marker (CD7) tegen een myeloïde marker (CD33). Poort van de afwijkende bevolking (Zie voor richtlijnen aanvullende bestand 1) en ‘LAIP positieve’ te noemen in de structuur van de bevolking.Opmerking: De finale gekozen LAIP is gerapporteerd als % LAIP op de bevolking van de ontploffing. De gevoeligheid, specificiteit en stabiliteit van de LAIPs kunnen alleen door personeel met ruime ervaring in MRD metingen worden vastgesteld. Het totaal van deze parameters bepaalt de kwaliteit van de LAIP. Voorbeelden van vier verschillende LAIP evaluaties tot diagnose zijn afgebeeld in Figuur 5 A-D. De expressie van LAIPs (% op ontploffingen) bepalen en bewaren van deze gegevens in een database of excel-bestand. Maak rapporten van de FACS analyses en de noten van de LAIPs die dienen te worden aangewend ter MRD metingen.Opmerking: De definitie van LAIPs is toegestaan in een team van deskundigen omdat het is een wezenlijk kenmerk voor nauwkeurige metingen van de MRD op follow up. MRD bij follow-up Poort van de ontploffing, zoals beschreven in punt 5.1, maar afhankelijk van het tijdstip na therapie; juiste beoordeling van deze poort kan worden uitdagende. Focus op het fenotype LAIP dat werd opgericht bij de diagnose en poort van de jonge bevolking. Zoals beschreven in punt 5.1. vind de juiste blast poort op basis van de gedefinieerde aberrancy en zich bewust zijn van het regenereren van beenmerg en normale expressies om hen uit gate Herhaal hetzelfde gating strategie helemaal follow-up punten en MRD LAIP cellen in de hele witte bloedcel bevolking in procenten te bepalen. Zie bijvoorbeeld figuur 6A en 6B. Verslag MRD positiviteit wanneer de gewichtspercenten MRD ≥ 0,1% van de witte bloedcellen. Afdrukken van geanalyseerde gegevens in een standaardindeling te bespreken wekelijks met het team MRD. Registreer de resultaten nadat overeenstemming is bereikt. Laat de resultaten door de toezichthouder worden toegestaan voordat de resultaten naar de clinici communiceren. 6. analyse van de stam cel MRD (LSC één buis)14 Analyses van de LSC bij de diagnose en opvolging Poort de blast cellen zoals beschreven in paragraaf 5.1. Gate als potentiële negatieve controle voor CD38-, erytrocyten-fractie (d.w.z. resterende rode bloedcellen na lysis, als SSClaag/FSClaag en CD45negatievegekenmerkt). Indien nodig, kunnen dode cellen en cel fragmenten worden uitgesloten door een extra poort in dit perceel. Bepalen binnen de leukemische blast-poort de subpopulatie met expressie van CD34. Selecteer binnen deze populatie de CD34+ CD38- cellen (gebruiken als cut-off: bovenste grens van de parels van de lege kalibratie voor drempel bepaling (zie tabel van materialen), de rode-breuk of gebruik 103 als cut-off punt). Bel deze populatie ‘CD38lage progenitoren’ (Figuur 7).Opmerking: Zie aanvullende bestand 1 voor meer informatie over de instelling van de niveaus voor de CD38-cut-off. Bepalen binnendeze dunbevolkte CD38 de werkelijke CD34 + CD38zeer lage stamcel bevolking, met behulp van de mediaan van de rode breuk, de onderrand van de lege kalibratie kralen of kies 102 als cut-off punt (Figuur 7 ). Zie aanvullende bestand 1 voor meer informatie over het instellen van de niveaus voor de CD38-cut-off. Binnen beide populaties, gate de leukemische cellen van de stam vs. de normale hematopoietische stamcellen (LSC vs HSC) door het analyseren van iedere leukemische markeerdraad geboden in het deelvenster (dat wil zeggen CD45RA, combi-6 (CLEC12A, TIM-3, CD7, CD11b, CD22 en CD56 all-in-PE), CD123, CD33 en CD44). Plot stamcel marker van belang ten opzichte van de andere markeerdraad van de cel van de stam te vergelijken positiviteit/negativiteit met positiviteit/negativiteit van andere markeringen en te fine-tunen van LSC versus HSC frequentie. Verslag van het percentage van de ontploffingen van de onrijpe lymfocyten, CD34 + cellen. Lijst van alle afzonderlijke markeringen, het totale aantal CD38lage en CD38verylow en het aantal CD38lage en CD38verylow die marker positieve (en dus neoplastische). Selecteer voor de marker die best onderscheidt normale hematopoietische stamcellen vs. leukemische cellen van de stam voor nadere analyse. Bereken het percentage van de LSC en HSC als percentage van totale WBC.Opmerking: Een percentage van de LSC van ≥ 0.004 is gerapporteerd als LSC positieve op diagnose, terwijl de licht-donkerscheiding zich 0,0001% bij follow-up. Afwijkende cellen van de stam gating in follow-up monsters is vergelijkbaar met analyse zoals bij diagnose, cel nummers in de populaties van de cel van de stam kan echter zeer klein. Vandaar de noodzaak van het verwerven van voldoende gebeurtenissen.