サンプルおよび測定可能な残存病変と急性骨髄性白血病の白血病幹細胞を測定するプロセス骨髄に対する包括的なプロトコル

研究コードのガイドラインと VU 大学メディカル センターの研究倫理委員会をプロトコルに従います。 1. 骨髄穿刺およびサンプル準備 患者および材料の準備 1% リドカイン 16 ゲージ針を使用して 1 つまたは 2 つの 10 mL の注射器を入力します。21 g 針の針を交換してください。 時計ガラス 5 ta の 2 つの滴を置きます。 スライド ガラスを設定 (n = 一貫した患者番号と日付の 15) の塗抹標本。 患者を側臥位に配置します。優れた後腸骨棘を見つけて、ペンで印をつけます。注: 一般に、後方腸骨棘は腸骨稜と正中線の 1 つの手幅外側の遠位に位置する 1 つの手幅です。女性で実際背骨がもう少し側の, いくつかの男性は、もう少し内側にあります。 クロルヘキシジン 0.5 1 で皮膚を消毒円で外へ向かう目的生検領域からエタノールで %。 滅菌手袋のパッケージを開く、滅菌手袋、滅菌フィールドを作成するテーブル上のパッケージを置きます。吸引針をパッケージを開き、滅菌フィールドの上に配置します。 皮膚や皮下組織と最後に骨膜に潜入します。骨膜で直径 1 cm の領域が麻酔されているような方法でリドカインを管理します。注: 骨膜にリドカインの投与は、患者の快適さのための最も重要な要因の 1 つです。骨膜は導入針生検目的場所をタップすることで十分に麻酔されているかどうかをテストし、患者が痛みを感じているかどうかを求めます。ノートの: 子供は完全に全体の手順中に麻酔。 吸引針を保持 (15 Ga x 2.8″) 手のひらと人差し指先端; 近くの針の金属シャフトの側面に対しての近位端でこの位置よりよい制御をことができます。 腸骨棘に向かって皮膚を通して (pronating supinating 運動を交互にすばやく) して回転運動針を導入し、後方腸骨棘と接触針をもたらします。 つまり針、麻酔; 骨膜部に導入されてであることを確認します。患者は、圧力と痛みだけを感じるはずです。患者が痛みを感じている場合、針の位置を変更またはより多くのリドカインを管理します。 穏やかな圧力を使用して、交互のカウンター時計回り時計回りに動きで回転しながら針を進めます。骨髄腔への入口は、低下抵抗によって一般に検出されます。 針から、スタイレットを削除します。10 mL 空の注射器を針に付けます。 ゆっくり引いてシリンジのプランジャーを撤回することによって否定的な圧力を適用します。彼ら可能性があります感じることけいれん感覚と痛みときに骨髄を吸引されているが、患者に警告します。十分な骨髄スピキュールがリリースされた場合別の吸引は 1 つのクイック ドローを実行必要があります。ほとんどのスピキュールは、初期のプルから得られる最初の 1-2 mL になります。試料の希釈を避けるために 1-2 mL のみを吸い出しなさい。注: 希釈希釈になります、MRD 結果を混同するかもしれない)。 注射器を削除し、吸引針に、スタイレットを置き換えます。時計ガラスとヘパリン コーティング 8 mL チューブに残りの部分に骨の髄の部分を取り出します。注: は、十分な抗凝固療法を確保するため試料管に骨髄穿刺直後に各チューブを反転します。骨髄の血液凝固は、しばしば不適切な材料の原因です。追加の骨髄は同じ場所から吸引することができますが、好ましくは、新しい吸引を行う前に針は 5-10 の mm を進められます。できれば挿入レベルごとの以上 2 の引き分けを取られるべき。最初を表す数の増加とチューブをマークすることを確認、2 番目および/または連続を描画します。最も関連性の診断分析に最初のドローを使用する一般的なルールです。 または、挿入場所から針を撤回し、骨髄腔元の挿入場所からが数ミリに再導入、手順を繰り返します。注: は、重要な血液汚染を避けるため、プルあたり 1-2 mL 以上を吸い出してはいけない。 材料は、必要に応じて頻繁に繰り返します。特定臨床試験プロトコルのための十分な材料を吸気骨髄針を削除します。注: 低速またはそうでなければ困難な骨髄の抱負の場合事前紅潮した抗凝固剤が注射器の使用役に立つかもしれません。乾燥のタップの場合この原稿の範囲外であるトレフィン生検を行います。 塗抹標本の形態学的検査のための準備 最適な形態学的評価、時計ガラスの吸引から (例えばプラスチック製のヘラを使用して) スピキュールを選ぶし、スライド ガラスの上に置きます。 優しく骨髄を使用してスライドを別のスライド ガラスを配置し、ゆっくりスライドさせます。任意の圧力を避けます。注: 非常に大きな骨髄スピキュールの場合にのみわずかな圧力が出されなければ、拡散セルの厚さを減少します。検体チューブを扱うことができるアシスタントからのヘルプからプロシージャの利点。患者数と多数のシーケンシャル骨髄描きチューブの正確なラベリングが重要です。 スライドを徹底的に乾燥し、ギムザ グリューンヴァルトの可能性があります染色 (材料の表を参照) を行います。形態を顕微鏡下で調べます (図 1参照)。注:図 1 aは、図 1 b中の異なる機能を細胞型主に白血病細胞を急性骨髄性白血病患者で構成される健康な骨髄塗抹標本を示しています。残留白血病負担の定義より、診療を実行する必要があります。 2. さらに処理するための物質の輸送 サンプルの輸送のための準備 材料がリークが発生しないとチューブが壊れないことを確認するには、するために適切なパッケージを確保する (図 2参照)。注: から私たちと細胞の生存率を経験その他骨髄が室温で保たれるときが最高の保存状態です。長期輸送のためこれは最高、輸送中に温度安定性を支援するため室温「ジェルパック」を使用して実現されます。 パッケージのラベル、パッケージ、長時間輸送の損失を避けるために正しいフォームを追加または患者の切り替え。注: これは、少なくとも含める必要があります: (フォーム 1) 患者データ。これは、研究数と一般的 ‘誕生日’ を含める必要があります。受信側のラボに到着後、素材の権利処理に不可欠な具体的に要求された研究室解析 (分子診断、診療、MRD など) このフォーム上での明確な声明です。(様式 2)住所と電話番号連絡担当者と必要に応じて、税関の論文。メールでパッケージを失うことを避けるため、常に送信所がサンプルが送信された受信のラボを通知します。「トラックとトレース」使用をお勧めします。 他の機関からのサンプルを受信 研究所で配信されるとすぐに研究室にサンプルを受信する研究所で適切な物流が設定されていることを確認します。注: 最適な物流組織できれば中央研究所が必要なためは受信し、地元の診療所から、外部の病院から、すべての材料を収集します。特に、総合経営研究所と明確なコミュニケーションのためのプロトコルの割り当てが欠かせません。 サンプルを受け取った後正確にハード コピー フォームおよび MRD ID トライアル固有 ID 番号、病院登録番号、生年月日、材料送信所などの重要なフィールドが含まれているセキュリティで保護されたデータベースの適切な番号メモします。種類 (骨髄または末梢血)、白血球数 (WBC)、骨髄穿刺の日付、計測の品質のサンプルとの発言関連の測定の日。注: このデータベースは追加データを含む (またはその他のデータベースにリンクする) 装備されても好ましくは、分析結果とさらに患者データ フォロー アップ データなど。 3. 流れの Cytometer セットアップ 注: このセクションは、Euroflow 指示に基づいています。11 FCS SSC パラメーターとターゲット蛍光チャネル用光電子増倍管 (PMT) 電圧の設定します。 FCS SSC のパラメーターは流れの cytometer を起動し、」Cytometer セットアップと追跡 (CST)「CST ビーズ (材料表を参照) を流れの cytometer で実行を実行します。(セクション 4.1 で説明) 健康なドナーから赤血球を溶解させます。 新しいテストを作成 (メニューで: 新しい実験実験選択空白の実験) 製造元のソフトウェアを使用して (材料の表参照) 対脇散布 (SSC) ドット プロット FSC と SSC のパラメーターを設定するための前方散乱 (FSC)。この実験 FSC/SCC PMT 日付を名前します。まず現在の cytometer 設定を使用 (右クリック:「現在 CST を適用」)。これらの設定は、CST キャリブレーション ビーズ (材料の表を参照) を使用して CST パフォーマンス チェックで生成されています。「グローバルな実験設定」でリンパ球を視覚化する FSC と SSC を調整します。注: 私達の流れの cytometer でこれらは、285 V、400 V それぞれ。「有効にする補償」で確認: インスペクター/楽器設定/補償。 セル (FSC) と粒度 (SSC) のサイズを評価するためにラベルのない測定を開始は、「セルを取得」関数によって末梢血細胞を分離。リンパ球と調整/微細 tune FSC と SSC 電圧ゲート リンパ球の人口の次の平均目標値に到達するためのゲート: FSC: 100,000 (105,000 95,000 の範囲);SSC: 15,000 (13,000 17,000 の範囲)。 取得し、少なくとも 10,000 のイベントを測定することによりデータを記録します。FSC の意味を確認し、SSC ゲート リンパ球のための目標値と、必要に応じて再調整します。 ターゲット蛍光の設定チャンネル PMT 電圧 8 ピーク虹ビーズ キャリブレーション粒子 (物質の表を参照) を使用します。 7 ピーク FACS に新しいテストを作成します。すべての必要なドット プロットとワークシート「ターゲット平均蛍光の強度 (MFI)」を作成 (n = 2;SSC は、FITC と PE と FSC)、ヒストグラム (n = 各蛍光検出器のための 8; 1 つのヒストグラム) と各蛍光チャネルの参照ピーク値 (MFI と変動 (CV) 係数) を示す統計。 DH ソリューションでビーズをミックスする2の O を優しく渦の 1 mL の虹ビーズの 1 滴 (± 60 μ L) を含む溶液を調製たて。 上から FSC/SSC 電圧および 5,000 のしきい値を持つ「低」流量 (記録) することがなく「取得」関数を使用して虹ビーズの蛍光測定開始の PMT の設定を使用します。門対 SSC ドット プロット fsc 一重項ビーズ人口 P1「長方形ゲート ボタン」を使用します。7thピーク – 対 PE ドット プロット FITC で人口 P2 のゲートします。 ビーズを定める注釈付きの MFI ターゲット チャンネルによるとターゲットの MFI の値に到達するための蛍光管内 7 ピーク虹ビーズ懸濁液および調整/微細 tune PMT 電圧の買収を続けます。 約 10,000 のイベントのデータを収集し、7番目の MFI をチェックする「レコード」を使用してピーク ビーズ。必要な場合は、PMT 電圧を修正します。7番目のピークの MFI ターゲット値に達すると一度、PMT の最終的な値のファイルをレコード/上書き。 PMT の最終的な値を保存し、製造元のソフトウェアのカタログに保存される日付と PMT セットアップ ファイルの名前します。以上各蛍光色素の流出を修正するためには、この PMT セットアップを使用します。 蛍光補正設定 無染色のコントロールと各螢光色素共役抗体のための管のラベル (使用される螢光色素のテーブル S1 を参照)。各チューブにバッファーの 100 μ L をピペットします。 渦多色補償ビーズのバイアル (材料の表を参照) 徹底的にし、各チューブにこれらのビーズの 1 完全なドロップ (± 60 μ L) を追加。注: は、各チューブにそれらを追加するとき、管の側面の下のビーズを滴下を避けてください。これはビーズを低濃度につながることができます、補償行列の結果に影響を与える可能性があります。 適切なボリュームが十分な蛍光色素標識された抗体の 1 つのテストの計算 (106細胞を染色するのに十分だろう)、ピペット対応する管と渦に徹底的に。無染色制御管に抗体を追加しないでください。常温 (RT) 暗闇の中で 15 〜 30 分間インキュベートします。 4 mL の洗浄バッファーを追加 (リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)/0.05% azide-0.1% ひと血清アルブミン (HSA) (材料の表参照)) 各管に。300gチューブを遠心分離機の 10 分は、上澄みを除去し、各チューブに 0.2 mL の洗浄バッファーを追加することによってビード ペレットを再懸濁します。渦管徹底的に。 製造元の解析ソフトウェアを開く (材料の表参照) 新しいテストを作成し、(メニューで: 新しい実験実験選択空白の実験)、現在日付の補正ファイルとして名前を変更します。 「Cytometer 設定」に移動し、セクション 3.1 から PMT 設定を使用。5,000、FSC のしきい値は、使用されるすべての螢の補正値がゼロであることを必ずです。 必要に応じてラベル固有チューブを含む補正コントロールを作成します。無染色のコントロールを必ず入れてください。メニューから選択: 補正コントロールを作成する実験、補償セットアップ。 無染色コントロール チューブをロードし一重項ビーズ人口周り P1 ゲートを調整し、P1 ゲートに一重項ビーズだけが含まれていることを確認します。 P1 ゲートを右クリックし、「適用をすべて補正コントロール」を選択します。すべての単一のラベルの付いた蛍光管用データを記録。P2 ゲート各蛍光ヒストグラムに肯定的な人口を包含するを確認します。場合は、ゲートを調整する必要があります。 補償金を計算します。選択実験、補償のセットアップは、賠償額を計算します。 補償の計算に失敗した場合は、エラー メッセージが表示されます。必要な調整を行い、再計算します。補償の計算が成功した報酬設定の名前の入力を求めるダイアログが表示されます。 (例えば YY-MM-DD 8 色セットアップ) の名前を入力、クリックして、リンクおよび保存します。補償のセットアップは、補償セットアップ カタログに保存されます。注: 同じの同時を使用してすべての実験の同じ設定を使用できます。 4. 流れフローサイトメトリー評価 (LAIP ・ LSC) 注: ここで我々 は WBC の最寄りの濃度を染色することができます染色前に一括溶解手順をについて説明します。ほとんどの MRD プロトコルは、いくつかは正常に溶解する前に染色などその他のオプションを使用しているがこの方法を使用します。全体の骨髄が溶解する前に染色優遇セル損失12を最小限に抑えられますが、予測不可能なあまりにも低濃度の欠点があります。 セルの一括溶解注意: 非操作サンプル水平常温では、フロー cytrometric 買収は、全体の手順に次の日を開始するために同じ日を実行できない場合。 サンプルを数回反転による同質性に抗凝固療法の骨髄サンプルを再懸濁します。細胞染色液 Tuerk とチャンバーを数えるセルを用いた骨髄細胞 (白血球数 (WBC)) の濃度 (材料の表を参照)。 別 15 mL チューブに骨髄の必要な量をピペットで移しなさい。細胞の量は染色の個別のチューブ; 数に依存1 染色 (1 つの管) LAIP 測定や LSC 管の測定 8 × 106白血球の約 2 × 106白血球細胞を使用します。 溶解のソリューションを追加することで赤血球を溶解 (材料の表を参照)。ソリューションを溶解の必要量は、細胞懸濁液の 10 倍の量をする必要があります。 優しく、逆解析による混合し、室温 10 分間インキュベート(例えば、真空ポンプやパスツール ピペット) 清 RT。 破棄で 7 分 800 g の遠心分離機します。リン酸緩衝生理食塩水で細胞ペレットを再懸濁します (PBS)/0.05% azide-0.1% ひと血清アルブミン (HSA) (材料の表参照) 使用したチューブの最大の音量で。 室温 7 分 800 g の遠心(真空ポンプまたはパスツール ピペット) などで上澄みを廃棄します。再 PBS/0.05% azide-0.1% HSA 100 × 106 WBC/mL の細胞濃度で細胞ペレットを中断し、意図したチューブの数を除算します。 フローサイトメトリー用の細胞の染色 ピペット モノクローナル抗体 (MoAb) カクテル ソリューションは、適切な蛍光活性化細胞選別機 (FACS) チューブにミックスし、暗闇の中で 15 分間分離骨髄細胞で孵化させなさい。注: これはタンデム染料が使用されるとき非常に重要です。たとえば、標準研究室 (テーブル S1) で使用されるパネルのミックスを参照してください。 3 mL PBS/0.05% azide-0.1% セルは洗ってください。400gで 5 分間細胞を遠心します。(例えば、真空ポンプやパスツール ピペット) 清と 300 μ L PBS/0.05% azide-0.1%HSA の細胞ペレットを再懸濁します破棄します。 LSC 測定: 400 μ L PBS/0.05% azide-0.1% HSA で細胞ペレットを再懸濁し、空白のビーズの 4 μ L を追加 (例: Spherotech、材料の表を参照してください) 陰性対照の人口分析として使用します。 MRD または LSC 実験レイ-を開く、FACS に (材料の表参照) の MRD 少なくとも 100,000 WBC 測定ゲートの診断で 1 × 106 WBC フォロー アップでのサンプリングが急性骨髄性白血病の急性骨髄性白血病患者のサンプルの測定イベントと。LSC の実験は少なくとも 4 × 106 WBC 診断と信頼性の高い LSC 結果のフォロー アップの両方を測定します。 結果の分析のための標準化された適切なファイル名を使用してデータを保存します。急性骨髄性白血病細胞と急性骨髄性白血病幹細胞 (正、負、上/下式) の異なる測定マーカーの目録を作り、実験室ジャーナルにこれらのデータを格納します。 LAIP 利用可能な診断がない場合に、あらゆる可能な測定可能な LAIP 可能性があります異なるから通常の方法で識別することを確認するフォロー アップですべての 4 つの管を測定します。 診断で最も信頼性の高い LAIP(s)13を選択し、可能な限りできるだけ多くのイベントを取得が、> 最小番号が定義されています。 5. 白血病関連免疫表現型 (LAIP) の同定: 異なる細胞集団の解析 注: (材料の表参照) の異なる細胞集団の最適な可視化のためのいくつかのソフトウェア プログラムを FCS ファイルを分析できます。 白血球細胞の人口 ゲート CD45 陽性細胞および、FSC/SSC プロット; 内低 FSC (非実行可能なセル、赤芽球系細胞) を残しての現われる生菌WBC (図 3 a私) が含まれます。WBC を表示し、(たとえば CD34;プリミティブのマーカーの 1 つを使用図 3Aii) ・ デ ・ CD45dim 地区 (図 3 aiii) 爆発の最終的な位置を確認するために。 CD45dim 細胞をゲートし、戻ってゲート (図 3B私) FSC/SSC プロット内のセル。% 細胞がこの門でプログラムの人口ツリー % 爆発を報告している間 (図 3Bii) CD34 ゲートを削除します。SSC/CD34 で爆発プロットおよび CD34 陽性細胞 (図 3Biii) をゲートを表示します。 リンパ球 内部統制としてリンパ球を使用: 陰性対照および肯定的な制御としてリンパ球集団として骨髄性集団。 白血細胞 (図 4 a) から開始します。CD45 の高い/SSC低の人口 (図 4 b) としてゲート リンパ球。 CD13 負/CD33 陰性細胞 (図 4C E) の CD34、CD117、CD13、CD33、ゲートを用いたゲートで骨髄系細胞がないことを確認してください。人口ツリー (図 4 階) でこの人口 ‘球’ を呼び出します。 診断 LAIP ゲートの爆発とその後 SSC/cd34 陽性の CD34 陽性細胞をプロットし、人口ツリーのこれらの ‘プリミティブ マーカー’ を呼び出します。 この場合 CD34 陽性のリンパ球の新しいプロットで、原始的な細胞を骨髄系マーカー (CD33) に対するリンパ球のマーカー (CD7) とプロットします。ゲートの異常な人口 (ガイドライン補足ファイル 1 を参照)、人口ツリーで ‘LAIP 肯定的な’ を呼び出します。注: 最後の LAIP を選択は、爆発の人口の %laip として報告されます。感度、特異性、安定性、LAIPs の MRD 測定で、十分な経験を持つ担当者だけで確立できます。これらのパラメーターの合計は、LAIP の品質を決定します。診断の 4 つの異なる LAIP 評価の例としては、図 5 A Dで与えられます。 LAIPs (爆発の %) の発現を決定やデータベースにこれらのデータを保持する excel ファイルです。 FACS 解析のレポートおよび MRD 測定で使用されなければならない LAIPs のノートを作る。注: をフォローで正確な MRD 測定にとって不可欠な機能ですので、LAIPs の定義は専門家のチームで承認されます。 フォロー アップで MRD 説明 5.1 時間ポイントによって治療後に爆発をゲートします。この門の正確な評価は困難な可能性があります。診断に設立された LAIP の表現型に注目し、未熟な人口をゲートします。 5.1 に記述されています。見つける正しいブラスト ゲートに基づいて定義された aberrancy とゲートのそれらをするために骨髄や通常の表現を再生成するのに注意してください。 すべてのフォロー アップのポイント戦略をゲートと同じことを繰り返すし、全白血球細胞人口の LAIP 細胞のパーセンテージとして MRD を決定します。図 6Aおよび6Bの例についてを参照してください。 MRD の % が ≥ MRD 陽性を報告、白血球細胞の 0.1%。MRD チーム相談毎週標準的な形式で解析したデータを印刷します。合意に達した後は、結果を登録します。結果を臨床医に通信する前に、スーパーバイザーによって承認される結果をみましょう。 6. 幹細胞 MRD (LSC 単管)14の解析 診断と経過観察に LSC の解析 セクション 5.1 で説明したブラスト細胞のゲートします。 CD38-潜在的なネガティブ コントロールとして赤血球画分 (すなわち赤い血液細胞換散、SSC低/FSC低と CD45陰性として特徴付けられる後に残り) をゲートします。必要に応じて、死んだ細胞や細胞断片がこの陰謀に余分なゲートで除外できます。 白血病ブラスト ゲート内 CD34 の式を持つ個体を決定します。この人口 CD34 内で select+ CD38-細胞 (カットオフとして使用: 空白キャリブレーション ビーズ閾値決定のための上部のボーダー (材料の表を参照)、赤分数または使用 10 カットオフ ポイントとして3 )。この人口 ‘CD38低前駆’ を呼び出します (図 7)。注: 設定について補足のファイル 1 を参照してください CD38-遮断レベル。 人口を決定この CD38低人口内真 cd 34 + CD38非常に低い幹細胞、赤の端数、空白キャリブレーション ビーズの下端の中央値を使用または 10 を選択2カットオフ ポイント (図 7).CD38-遮断レベルの設定の詳細については、補足のファイル 1 を参照してください。 パネルで提供されている各白血病のマーカーを分析することによって通常の造血幹細胞 (LSC 対 HSC) 対白血病幹細胞をゲート両方の人口の内で (すなわち CD45RA コンビ 6 (CLEC12A、CD56 PE ですべて、CD22 CD11b CD7 ティム 3)、CD44、CD33 CD123)。 その他の幹細胞マーカー陽性/陰性陽性/陰性の他のマーカーとを比較して HSC 周波数対 LSC を微調整すると興味の幹細胞のマーカーをプロットします。 未熟な芽球、リンパ球、CD34 陽性細胞の割合を報告します。すべての個別のマーカー CD38低と CD38、極めて小さい数の合計と肯定的な (およびこうして腫瘍) のマーカーである CD38低と CD38、極めて小さい番号をリストします。 さらなる分析のための白血病幹細胞と正常の造血幹細胞を最高区別マーカーを選択します。合計 WBC の割合として LSC と HSC の割合を計算します。注: カットオフはフォロー アップで 0.0001%、LSC ≥ 0.004% の割合が LSC 診断で陽性として報告をされます。フォロー アップのサンプルでゲート異常の幹細胞は、診断、しかし、茎セル人口の細胞数することができます非常に小さな分析に似ています。それゆえ十分なイベントを取得する必要性。