Örnek ve işlem kemik iliği ölçülebilir artık hastalık ve akut Myeloid lösemi lösemik kök hücre ölçmek için kapsamlı iletişim kuralı

Protokol kuralları araştırma kod ve araştırma Etik Komitesi VU Üniversitesi Tıp merkezinin izler. 1. kemik iliği aspirasyon ve örnek hazırlama Hasta ve malzeme hazırlığı Bir ya da iki 10 mL şırınga 16 lik bir iğne kullanılarak %1 lidokain ile doldurun. 21’lik iğne iğne değiştirin. İki damla % 5 EDTA izle cama koy. Cam slaytları ayarla (n = 15 tutarlı hasta numaralandırma ve tarihi ile) smear hazırlıkları için. Hasta yanal dekübitus bulunduğu yer. Üstün posterior iliyak omurga bulun ve kalemle işaretlemek.Not: genel olarak, posterior superior İliak omurga bulunduğu bir yandan iliyak sorguç ve bir yandan genişliği lateral orta hat için distal genişliğidir. Kadın, gerçek omurga biraz daha bazı erkeklerde biraz daha medial lateral olabilir. Cilt klorheksidin 0.5-1 ile dezenfekte % alanından amaçlanan biyopsi dışa çevrelerde etanol içinde. Steril eldiven paketi açın, steril eldiven takmışım ve paket steril bir alan oluşturmak için tablonun üzerinde aşağı yattı. Paket aspirasyon iğne ile açın ve steril alan üzerine yerleştirin. Deri ve subkutan doku ve nihayet kapaklarini sızmak. Kapaklarini lidokain 1 cm çapında bir alanı anestezi şekilde yönetmek.Not: Lidocaine kapaklarini için yeterli yönetim hasta konforu için en önemli faktörlerden biridir. Kapaklarini-var yeterli anestezi tanıtılan iğne ile amaçlanan biyopsi konuma dokunarak sınamak ve hasta herhangi bir ağrı hissettiğini sordun. Not: çocuk tam olarak tüm prosedürü sırasında anestezi. Aspiratı iğne tutun (15 Ga x 2.8″) proksimal sonunda palm ve iğne metal şaft ucuna; yakın tarafına işaret parmağı ile Bu konumu daha iyi kontrol sağlar. Dönen bir hareketi ile iğne (hızlı bir şekilde hareket pronating/supinating değişen) iliyak omurga doğru deri yoluyla tanıtmak ve posterior iliyak omurga temas iğne getir. Bu iğne kapaklarini imzalat alanına giriliyor sağlamak; hasta sadece baskı ve hiçbir ağrı hissetmeniz gerekir. Eğer hasta ağrı hisseder, iğne yeniden konumlandırmak veya daha fazla lidokain yönetmek. Nazik ama sert basınç kullanarak, iğne bir alternatif saat yönünde-counter saat yönünde hareket halinde iken döner ilerlemek. İliği kavite içine giriş genellikle düşük direnç tarafından algılanır. Stylet iğneden kaldırın. 10 mL boş Şırıngayı iğneye takın. Negatif basınç şırınga pistonu nazik bir çekme ile çekilerek uygulanır. Hastanın kemik iliği emişli ne zaman onlar bir kramp hissi ve ağrı hissedebilirsiniz uyarmak. Eğer yeterli kemik iliği spicules serbest, başka bir aspirasyon ile bir hızlı çizmek yapılmalıdır. Çoğu spicules ilk çekin arasında elde edilen ilk 1-2 mL olacak. Sadece 1-2 mL örnek sulandrarak önlemek için Aspire edin.Not: Seyreltme içinde hemodilution neden olur ve MRD sonuçları yıkmak). Şırınga kaldırıp stylet aspirasyon iğne yerleştirmek. İlik parçası izle cam ve geri kalanı ile heparin kaplı bir 8 mL tüp içine içine dışarı atmak.Not: her tüpün iliği aspiratı yeterli anticoagulation emin olmak için numune tüpüne getirdikten hemen sonra tersine çevirin. Kemik iliği koagülasyon kez uygunsuz malzeme nedenidir. Ek kemik iliği aynı noktadan emişli, ama tercihen, yeni Aspire edin çekilmeden önce iğne 5-10 mm ileri düzeydedir. Tercihen ekleme level başına 2’den fazla berabere alınmalıdır. İlk temsil eden sayıları artan ile tüpler işaretlemek emin olun, ikinci ve/veya üst üste çekiyor. İlk çizmek için en uygun tanılama analiz kullanmak için genel bir kuraldır. Alternatif olarak, iğne ekleme yerden geri çekmek ve iliği boşluğuna özgün ekleme Place birkaç milimetre içine reintroduce ve yordamı yineleyin.Not: birden fazla 1-2 mL başına çekme önemli kan kirlenmesini önlemek için Aspire değil. Malzeme gerektiğinde kez tekrarlayın. Kemik iliği iğne belirli klinik çalışma protokolü için yeterli malzeme emişli kaldırdığınızda.Not: yavaş veya aksi takdirde zor kemik iliği durumunda önceden antikoagülan ile kızarmış şırınga kullanımı yararlı olabilir. Kuru bir musluk durumunda, bu yazının kapsamı dışında olan bir trephine biyopsi yapın. Morfolojik muayene smear hazırlanması En iyi morfolojik değerlendirmesi için (örneğin bir plastik spatula kullanarak) spicules izle-cam aspiratı üzerinden ortaya çıkarmak ve onlara bir cam slayt üzerinde yer. Yavaşça iliği ile slayt üzerine başka bir cam slayt getirin ve yavaşça kaydırın; herhangi bir baskı kaçının.Not: Yalnızca çok büyük kemik iliği spicules durumunda hafif basınç, hücre yayılma kalınlığı azaltmak için sarf. Yordam yarar–dan numune tüpleri işleyebilir bir yardımcıya yardım. Tüpler numaralı hasta ve sıralı kemik iliği beraberlik sayısı ile doğru etiketleme çok önemlidir. Slayt iyice kurulayın ve Giemsa Grünwald olabilir (malzemelerin tabloya bakın) Boyama gerçekleştirin. Morfoloji için ışık mikroskop altında incelemek (bkz. şekil 1).Not: Şekil 1A sağlıklı kemik iliği ağırlıklı olarak lösemik patlamaların AML hastayla farklı işlevsel hücre tipleri şekil 1B sırasında oluşan smear gösterir. Artık lösemik yükü daha iyi tanımlamak için immunophenotyping yapılması gerekiyor. 2. taşıma için daha fazla alay malzemesi Taşıma için örnek hazırlanması Malzeme değil sızıntısı olacak ve tüpler kırmayacak emin olmak için doğru ambalaj emin olun (bkz. Şekil 2).Not: Gelen bizim ve diğer hücrelerin canlılık deneyimleri kemik iliği oda sıcaklığında tutulur en iyi korunur. Uzun vadeli taşıma için bu en iyi iletim sırasında sıcaklık kararlılığı içinde yardım etmek için bir oda sıcaklığında ‘jel-paketi’ kullanarak elde edilir. Etiket paketleri ve paket, uzun süreli taşıma kayıplarını önlemek için doğru form eklemek veya hastaların geçiş.Not: Bu en az içermelidir: (Form 1) hasta veri. Bu çalışma numarası ve yaygın olarak ‘Doğum tarihi’ içermelidir. Açık bir ifade bu form üzerinde özellikle analiz (Moleküler Diagnostik, immunophenotyping, MRD vb) istenen laboratuvar malzeme doğru işlenmesi alıcı laboratuarındaki geldikten sonra gereklidir. (Form 2) Adres ve telefon numarası bir ilgili kişi, ve ne zaman gerekli, kağıtları gümrük için. Gönderen laboratuvar posta paketlerinde kaybını önlemek için her zaman gönderilen bir örnek alıcı laboratuvar bildirir. “Parça ve izleme” kullanılması önerilir. Diğer kurumları alıcı örnekleri Uygun lojistik Enstitüsü Enstitü’de teslim olarak Laboratuvarı örnek almak için yerinde olduğundan emin olun.Not: en iyi lojistik organizasyon tercihen bir Merkez Laboratuvarı için hangi alır ve yerel klinik ve dış hastaneleri tüm malzeme toplar. Özellikle, dağıtım ve yönetim Laboratuvarları ile açık iletişim protokolleri atama esastır. Örnekleri aldıktan sonra doğru bir şekilde basılı form ve MRD Sicil no, deneme belirli kimlik numarası, hastane kayıt numarası, gönderme Enstitüsü, doğum tarihiniz, malzeme gibi önemli alanlar içeren güvenli bir veritabanını uygun numaralandırma Not türü (kemik iliği veya periferik kan), beyaz küre sayısı (WBC), kemik iliği aspirasyon tarihi, ölçüm kalitesi için örnek ve herhangi bir açıklaması ilgili ölçüm tarihi.Not: Tercihen, bu veritabanı de ek veriler içerir (veya diğer veritabanlarına bağlanacak) donatılmış analiz sonuçları ve daha fazla hasta veri izleme verileri gibi. 3. Akış Sitometresi Kur Not: Bu bölümde Euroflow yönergeler temel alır. 11 FCS SSC parametreleri ve hedef Floresans kanalları photomultiplier (PMT) gerilimleri set FCS SSC için parametreleri Akış Sitometresi başlatın ve “sitometresi kurulum ve izleme (Akış Sitometresi (malzemelerin tabloya bakın) CST boncuk ile çalıştırmak CST)” gerçekleştirmek. Kırmızı kan hücreleri (4.1 bölümünde açıklanan) sağlıklı bir donörden parçalayıcı. Yeni bir deneme oluşturun (menüde: deney, yeni deneme, boş deneme seçin) üreticinin yazılımını kullanarak (malzemelerin tabloya bakın) karşı yana dağılım (SSC) nokta çizim FSC ve SSC parametreleri ayarlamaya yönelik ileri bir dağılım (FSC) ile. Bu deney FSC/SCC Devresel ödeme tarihi ile ad. İlk geçerli sitometresi ayarları kullanmak (sağ tıklayın: “Şu anki CST uygulamak”). Bu ayarları CST performans onay CST-kalibrasyon boncuk (malzemelerin tabloya bakın) kullanarak üretilmedi. FSC ve SSC lenfositler “küresel deney ayarlarında” görselleştirmek için ayarlayın. Not: bizim Akış Sitometresi 285 V ve 400 V sırasıyla bunlar. “Etkinleştirmek tazminat” check-in: Müfettiş/araç ayarları/tazminat. Hücreleri (FSC) ve parçalı yapı (SSC) boyutunu değerlendirmek için etiketlenmemiş ölçme başlangıç periferik kan hücreleri “hücreleri elde etmek” işlev tarafından lysed. Kapı lenfositler ve aşağıdaki ortalama hedef değerleri için geçişli lenfosit nüfusun ulaşmak için ayarlamak/fine-tune FSC ve SSC voltaj: FSC: 100.000 (Aralık 95.000 105,000); SSC: 15.000 (Aralık 13.000-17.000). Elde ve en az 10,000 olayları ölçerek verileri kaydetmek. Demek FSC doğrulayın ve SSC Kapı lenfositler için değerleri hedef ve gerekirse yeniden ayarlayın. Hedef Floresans kurmak için kanal Devresel_ödeme voltaj (malzemelerin tabloya bakın) 8-tepe gökkuşağı boncuk kalibrasyon parçacıkları kullanın. 7-tepeler için FACS üzerinde yeni bir deneme oluşturun. Tüm gerekli nokta araziler ile “Hedef ortalama floresan yoğunluğu (MFI)” bir çalışma sayfası oluşturmak (n = 2; FSC SSC, FITC PE karşı karşı), çubuk grafikler (n her Floresans Dedektör için 8; bir çubuk =) ve her Floresans kanal için en yüksek değer (MFI ve varyasyon (CV) katsayısı) referans gösterilen istatistikleri. Taze gökkuşağı boncuk boncuk çözümde karıştırmak için dH2O. yavaşça girdap 1 ml 1 damla (± 60 µL) içeren bir çözüm hazırlamak. FSC/SSC gerilim yukarıdan ve gökkuşağı boncuk floresan bir eşik 5.000 ile “Düşük” akış hızında (olmadan kayıt) “elde” işlevini kullanarak ölçüm Başlat, devresel_ödeme ayarlarını kullanın. “Dikdörtgen kapısı düğmesini” Gate singlet boncuk kalabalıkta P1 FSC SSC nokta arsa karşı kullanın. 7inci tepe – FITC PE nokta arsa karşı nüfus P2 kapı. 7-tepeler gökkuşağı boncuk süspansiyon ve ayarlamak/fine-tune Devresel_ödeme gerilimleri edinimi boncuk ile sağlanan hedef MFI değerlerine göre ek açıklama eklenen MFI hedef kanalları ulaşmak için tüm Floresans kanallarda devam edin. Yaklaşık 10.000 olayların veri toplamak ve MFI 7th için kontrol etmek için “Kayıt” kullanmak en yüksek boncuk. Devresel_ödeme gerilimleri gerekirse düzeltin. Bir kez hedef MFI değerleri için 7th en yüksek ulaştı, kayıt/son Devresel_ödeme değerleri için dosyanın üzerine. Son Devresel_ödeme değerleri kaydetmek ve Devresel_ödeme kurulum olacak tarihi kaydetmek üreticinin yazılım Kataloğu’nda dosya adı. Bu Devresel_ödeme kurulum yayılım üzerinde her Floresans boya için düzeltmek için kullanın. Floresans telafisi ayarları Bir tüp günahı kontrol ve her fluorochrome konjuge antikor etiket (tablo S1 için kullanılan fluorochromes bakınız). 100 µL arabelleği her tüpün içine pipet. Girdap çok renkli tazminat boncuk şişe (tabloya malzemelerin iyice bakın) ve 1 tam damla (± 60 µL) her tüpün bu boncuk ekleyin.Not: her tüpün eklerken boncuk tüp tarafı aşağı damlayan kaçının. Bu düşük boncuk konsantrasyon için yol açabilir ve tazminat matris sonuçlarını etkileyebilir. (Ki 106 hücre leke için yeterli olacaktır) uygun birim antikor yeterli fluorochrome Birleşik bir test için hesaplanan pipet karşılık gelen tüp ve girdap içine iyice. Antikor günahı denetim tüp eklemeyin. 15-30 dakika içinde belgili tanımlık karanlık oda sıcaklığında (RT) için kuluçkaya. Yıkama arabellek 4 mL ekleyin (fosfat tamponlu tuz (PBS)/0.05% azide-0.1% insan serum albumin (HSA) (malzemelerin tabloya bakın)) her tüp için. 10 dk. süpernatant kaldırmak ve boncuk Pelet her tüpün 0.2 mL yıkama arabelleği ekleyerek resuspend 300g de tüpler santrifüj kapasitesi. Girdap tüpler iyice. Üreticinin analiz yazılımı açın (malzemelerin tabloya bakın) ve yeni bir deneme oluşturun (menüde: deney, yeni deneme, boş deneme seçin) ve tazminat dosyasını içeren geçerli olarak yeniden adlandırın. “Sitometresi ayarları” gidin ve 3.1 bölümünden Devresel_ödeme ayarını kullanın. FSC eşik 5.000 olduğundan ve sıfır kullanılan fluorochromes tazminat değerleri emin olun. Etiket özel tüpler, gerektiği gibi dahil tazminat denetimler oluşturun. Bir günahı denetimi eklemeyi unutmayın. Menü arasından seçim: deney, tazminat Kur, tazminat denetimleri oluşturmak. Günahı denetim tüp yüklemek ve P1 kapısı singlet boncuk nüfus etrafında ayarlamak ve P1 kapı sadece singlet boncuk içerdiğinden emin olun. P1 kapı sağ tıklatıp “Uygulamak için tüm tazminat kontrol eder”. Tek etiketli floresan tüpler için kayıt verileri. P2 kapısı her Floresans histogramı olumlu nüfusu kapsar doğrulayın. Eğer geçidi ayarlamak gerek. Tazminat hesaplayın. Seçme deney, tazminat Kur, tazminat hesaplayın. Tazminat hesaplama başarılı değilse, bir hata iletisi görüntüler. Gerekli ayarlamaları yapın ve yeniden hesaplayın. Tazminat hesaplama başarılı olduğunda, adı tazminat kurulum için isteyen bir iletişim kutusu görüntülenir. Bir ad (örneğin YY-AA-GG 8 renk ayarı) girin ve’ı tıklatın, bağlantı ve kaydedebilirsiniz. Tazminat Kur aynı zamanda tazminat Kur katalog için kaydedilir.Not: Aynı ayarları aynı fluorophores kullanan tüm deneyler için kullanılabilir. 4. Akış Sitometresi değerlendirmesi (LAIP ve LSC) Not: Burada biz WBC tercih edilen bir konsantrasyon leke sağlayan boyama önce toplu lizis açıklayınız. Bazı başarıyla lizis önce boyama gibi başka seçenekler kullanılmışsa, ancak çoğu MRD protokolleri bu yaklaşımı kullanın. Bütün kemik iliği lizis önce boyama tercihli hücre kaybı12en aza indirir ama öngörülemeyen, çok düşük hücre konsantrasyonları dezavantajı vardır. Toplu lizis hücreNot: akış cytrometric edinme ertesi gün tüm prosedürü başlatmak için aynı gün gerçekleştirilemediğinde unmanipulated örnekleri RT, yatay tutun. Anticoagulated kemik iliği örnek homojenliği için örnek birkaç kez ters çevirme tarafından resuspend. Bir hücre odası ile öngördüğümüz çözüm boyama Hücre sayımı kullanarak konsantrasyonu (beyaz küre sayısı (WBC)) kemik iliği hücrelerinin belirlemek (malzemelerin tabloya bakın). Damlalıklı ayrı 15 mL tüp içine kemik iliği gerekli hacmi. Hücre ayrı boyama tüpler sayısına bağlıdır; bir (tek tüp) boyama için yaklaşık 2 x 106 beyaz kan hücreleri LAIP ölçümleri ve 8 x 106 beyaz kan hücreleri LSC tüp ölçümü için kullanın. Lysing çözüm ekleyerek kırmızı kan hücreleri Parçalayıcı (malzemelerin tabloya bakın). Çözüm lysing gerekli birim hücre süspansiyon hacmi 10 kat olmalıdır. INVERSION tarafından karışımı yavaşça ve 10 dk RT. az için kuluçkaya RT atma de 7 dk 800 g için (örneğin bir vakum pompası veya ile Pasteur pipet) süpernatant santrifüj kapasitesi. Hücre Pelet fosfat tamponlu tuz resuspend (PBS)/0.05% azide-0.1% insan serum albumin (HSA) (malzemelerin tabloya bakın) RT. kullanım tüp maksimum hacmi itibariyle. Dik de 7 dk 800g için santrifüj süpernatant (örneğin ile bir vakum pompası veya Pasteur pipet) atmak. Hücre Pelet PBS/0.05% azide-0.1% HSA hücre konsantrasyonu 100 x 106 WBC/mL içinde yeniden askıya alma ve amaçlanan tüpler sayısı üzerinden bölün. Akış Sitometresi için hücre boyama Damlalıklı Monoklonal antikor (MoAb) kokteyl çözüm uygun floresan aktif hücre sıralayıcısı (FACS) tüpler içine karıştırın ve 15 dakika içinde belgili tanımlık karanlık lysed kemik iliği hücreleriyle kuluçkaya.Not: tandem-boyalar kullanılır bu zaman çok önemlidir. Örneğin, size bizim laboratuvar (tablo S1) kullanılan panellerin karışımları görürsünüz. Yıkama 3 mL PBS/0.05% azide-0.1% hücrelerle vardır. Hücreler için 400gde 5 dk santrifüj kapasitesi. Süpernatant (örneğin ile bir vakum pompası veya Pasteur pipet) ve resuspend hücre Pelet 300 µL PBS/0.05% azide-0.1%HSA içinde atmak. LSC ölçüm için: hücre Pelet 400 µL PBS/0.05% azide-0.1% HSA resuspend ve 4 µL boş boncuk ekleyin (örneğin Spherotech, malzemelerin tabloya bakın) negatif kontrol nüfus analiz olarak kullanmak için. MRD veya LSC deney lay-out FACS üzerinde açın (malzemelerin tabloya bakın) ve ölçü MRD en az 100.000 WBC için geçişli AML hasta numuneleri tanı ve 1 X 106 WBC AML örnekleri takip, ölçümü için olayları. LSC’yi için en az 4 x 106 WBC hem tanı ve takip için güvenilir bir LSC sonuç deneyler ölçmek. Verileri sonuçları analiz için bir standart uygun dosya adı kullanarak kaydedin. Farklı ölçülen işaretleri AML hücreleri ve AML kök hücreleri (pozitif, negatif ifade/üstü) bir envanterini yapmak ve laboratuvar günlüğünde bu verileri depolamak. Hiçbir tanı LAIP kullanılabilir durumda, olası herhangi bir ölçülebilir LAIP üzerinden normal farklı yaklaşımda tespit emin olmak için takip, tüm 4 tüpler ölçmek. Teşhisi en güvenilir LAIP(s)13 seçin ve mümkün olduğunca çok etkinliğinde elde ama > en az numaraları tanımlı. 5. kimlik lösemi ilişkili IMMUNO-fenotipleri (LAIP) in: farklı hücre popülasyonlarının analizleri Not: FCS dosyaları (malzemelerin tabloya bakın) farklı hücre nüfusun en iyi görüntüleme için birçok yazılım programı ile analiz edilebilir. Beyaz küre nüfus Kapı CD45 pozitif hücrelerinin ve düşük FSC (non-hücrelerin, erythroid hücreleri) FSC/SSC arsa içinde dışarıda bırakarak görünen hücrelerin, Bunlar WBC (şekil 3Aben) içerir. WBC göstermek ve bir ilkel işaretleri (örneğin CD34; kullanın Şekil 3AII) de CD45dim alan (şekil 3AIII) son pozisyonda, patlamaların tespit etmek için yardım etmek. CD45dim hücre kapısı ve geri FSC/SSC Arsa (şekil 3Bben) hücrelerde kapısı. CD34 kapısı (3Bii rakam) bu kapıyı % hücrelerde % patlamaların nüfus ağacında programı olarak raporlama kaldırın. SSC/CD34 patlamaların arsa ve CD34 pozitif hücrelerinin (Figure3Bill) kapı göster. Lenfositler Lenfositler bir iç denetimi kullanın: myeloid nüfus bir negatif kontrol ve pozitif kontrol olarak lenfoid nüfus olarak. Beyaz kan hücresi popülasyon (şekil 4A) başlatın. Kapı lenfositler CD45yüksek/SSCdüşük nüfus olarak (şekil 4B). CD34, CD117, CD13 veya CD33 ve kapı CD13 negatif/CD33 negatif hücreler (şekil 4C-E) için kullanma kapısı hiçbir myeloid hücre olduğundan emin olun. Bu nüfus nüfus ağacında (şekil 4F) ‘lenfositler’ diyoruz. LAIP tanı Patlamaların kapı ve daha sonra bir SSC/CD34 CD34 olumlu hücrelerde arsa ve bu ‘ilkel marker’ nüfus ağaç denilebilir. Myeloid işaretleyici (CD33) karşı bir lenfoid marker (CD7) ile bu durumda CD34 olumlu ve yeni bir komplo içinde lenfositler ilkel hücreleri çiz. Anormal nüfus (referanslara ek dosya 1 bakınız) kapı ve onları ‘LAIP pozitif’ nüfus ağacında arayın.Not: LAIP seçilen final % LAIP patlama nüfus olarak bildirilmektedir. Duyarlılık, özgüllük ve LAIPs kararlılığını geniş deneyime sahip personel tarafından sadece MRD ölçümlerde kurulabilir. Bu parametreler toplam LAIP kalitesini belirler. Tanı, dört farklı LAIP değerlendirmelerin örnek şekil 5 A-Dolarak verilmiştir. LAIPs (% patlamaların) ifadesini belirleyin ve bu verileri bir veritabanında korumak veya excel dosyası. FACS analiz raporlarının ve MRD ölçülerde kullanılması gerekir LAIPs notlar olun.Not: o kadar takip, doğru MRD ölçümler için temel bir özelliği olduğu LAIPs tanımını uzmanlardan oluşan bir ekip yetkilidir. MRD takibi Patlamaların 5.1 ama zaman noktası bağlı olarak tedavi sonrası açıklandığı gibi kapı; Bu kapı doğru değerlendirilmesi zor olabilir. Tanıyı kurulmuştur LAIP fenotip odaklanmak ve olgunlaşmamış nüfus kapısı. 5. 1’açıklandığı gibi. doğru patlama kapısı üzerinde tanımlanmış aberrancy dayalı ve onları dışarı kapı için kemik iliği ve normal ifadeleri yeniden oluşturuluyor farkında olmak bulmak Aynı strateji hiç takip Puan geçişi tekrarlayın ve LAIP hücreleri bütün beyaz küre nüfus yüzdesi olarak MRD belirlemek. Şekil 6A ve 6Börnekler için bkz. Rapor MRD pozitifliği MRD % ≥ olduğunda beyaz kan hücrelerinin % 0.1. Haftalık MRD ekibi ile görüşmek üzere standart bir biçimde analiz verileri Yazdır. Fikir birliği ulaşıldıktan sonra sonuçlar kaydedin. Let sonuçları klinisyenler için iletişim kurmadan önce Danışmanı tarafından yetkilendirilecek sonuçları. 6. analiz kök hücre MRD (LSC tek tüp)14 LSC’yi tanı ve takip analiz Blast hücre 5.1 bölümünde açıklandığı gibi kapı. İçin CD38-potansiyel negatif kontrol kırmızı hücreleri-kesir (yani kalan kırmızı kan hücreleri lizis SSCdüşük/FSCdüşük ve CD45olumsuzkarakterize sonra) kapı. Gerekirse, bu arsa bir ilave bir geçit tarafından ölü hücreleri ve hücre parçaları dışlanabilir. Lösemik blast kapı CD34 ifadesi ile subpopulation belirler. Seçin+ CD38 CD34 bu nüfus içinde- hücreleri (cut-off kullanın: boş kalibrasyon boncuk eşik tayini için üst sınır (malzemelerin tabloya bakın), kırmızı-kesir veya kullanım 103 kesme noktası olarak). Bu nüfus ‘CD38düşük ataları’ ara (Şekil 7).Not: See ek dosya 1 ayarı hakkında daha fazla ayrıntı için CD38-cut sakin düzeyleri. Bu CD38düşük nüfus içinde boş kalibrasyon boncuk alt kenarını kırmızı kesir sayılarının kullanarak doğru CD34 + CD38çok düşük kök hücre nüfus, belirlemek veya 10 seçin2 kesme noktası (Şekil 7 ). Ek dosya 1 CD38-cut sakin düzeyleri ayarlama hakkında daha fazla bilgi için bkz:. Masası’nda sağlanan her lösemik işaretçisi analiz ederek her iki nüfus içinde lösemik kök hücreler normal hematopoetik kök hücre (LSC vs HSC) vs kapı (yani CD45RA, Kombi-6 (CLEC12A, TIM-3, CD7, CD11b, CD22 ve PE’deki tüm CD56), CD123, CD33 ve CD44). Kök hücre işaretçisi pozitif/negatif pozitif/negatif diğer işaretleri ile karşılaştırmak için ve LSC karşı HSC frekans ince ayarını yapmak için diğer kök hücre marker karşı ilgi arsa. Olgunlaşmamış patlamaların, lenfositler, CD34 + hücre yüzdesi rapor. Hepsi ayrı işaretler için toplam sayıda CD38düşük ve CD38verylow ve marker pozitif (ve böylece neoplastik) olan numaraları CD38düşük ve CD38verylow listelenmektedir. Seçme işaretçisi için bu en iyi normal hematopoetik kök hücre lösemik kök hücreleri daha fazla çözümleme için vs ayırt eder. LSC ve HSC yüzdesi toplam WBC yüzdesi olarak hesaplayın.Not: kesme takip %0,0001 iken LSC ≥ %0,004 yüzdesi LSC tanı, pozitif olarak bildirilmektedir. Anormal kök hücre takip örnekleri çoğunluğuna analiz için benzer tanı, ancak, kök hücre popülasyonlarının hücre sayıları çok küçük olabilir gibi. Bu nedenle yeterli olaylar edinme gerekliliği.