Imagen tejidos amiloides manchado con Oligothiophenes conjugado luminiscente por hiperespectral Confocal la microscopia y la proyección de imagen de toda la vida de la fluorescencia
Summary
Deposición amiloidea es una seña de identidad de distintas enfermedades y afecta a muchos órganos diferentes. Este trabajo describe la aplicación de la fluorescencia oligothiophene conjugado luminiscente tinción en combinación con técnicas de microscopía de fluorescencia. Este método de coloración representa una poderosa herramienta para la detección y exploración de agregados proteicos en ajustes clínicos y científicos.
Abstract
Proteínas que el depósito amiloide en los tejidos en todo el cuerpo pueden ser la causa o la consecuencia de un gran número de enfermedades. Entre estos encontramos enfermedades neurodegenerativas como el Alzheimer y enfermedad de Parkinson que afecta principalmente el sistema nervioso central y el amyloidosis sistémico donde amiloide del suero A, transtiretina y IgG de cadenas ligeras de depósito amiloide en el hígado, carpal túnel, bazo, riñón, corazón y otros tejidos periféricos. Amiloide ha sido conocido y estudiado por más de un siglo, a menudo usando tintes específicos amiloides rojo Congo y tioflavina T (ThT) o tioflavina (ThS). En este papel, presentamos heptamer-formyl tiofeno acético (hFTAA) como un ejemplo de complemento recientemente desarrollado para estos tintes llamados oligothiophenes conjugado luminiscente (LCOs). hFTAA es fácil de usar y es compatible con la tinción de inmunofluorescencia Co o con otros marcadores celulares. Amplia investigación ha demostrado que hFTAA detecta una amplia gama de agregados de proteína enfermedad asociada que tintes amiloides convencionales. Además, hFTAA puede aplicarse también para asignación óptica de morfotipos distintos agregados para permitir estudios de polimorfismo de la fibrilla amiloidea. Mientras que la proyección de imagen metodología aplicada es opcional, aquí demostrar la proyección de imagen hyperspectral (HIS), microscopía confocal y vida de fluorescencia (FLIM) la proyección de imagen del laser. Estos ejemplos muestran algunas de las técnicas de imagen donde LCOs pueden utilizarse como instrumentos para obtener un conocimiento más detallado de la formación y propiedades estructurales de amiloides. Es una importante limitación a la técnica, en cuanto a todas las técnicas de microscopía óptica convencional, el requisito de tamaño microscópico de agregados para permitir la detección. Además, el agregado debe incluir una estructura repetitiva de β-hoja para permitir el enlace de hFTAA. Exposición excesiva fijación o epitopo que modifican la estructura agregada o conformación puede hacer vinculante hFTAA pobre y por lo tanto, presentan limitaciones para la proyección de imagen exacta.
Introduction
Depósito de amiloide en el tejido es una patológica en un número de enfermedades como la enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, amiloidosis sistémica y enfermedades priónicas. A pesar de la prevalencia de enfermedades relacionadas con el amiloide y el hecho de que cerca de 40 proteínas diferentes hasta la fecha han sido clasificados como precursores de amiloide en humanos1, poco se sabe sobre la relación entre deposición amiloidea y fenotipo de la enfermedad. Histología de muestras de pacientes humanos ha sido utilizada tanto para propósitos de diagnóstico y científicas. Se han establecido un gran número de modelos animales para investigar la correlación entre la carga amiloide y comportamiento, vida útil y un número de otros leer fenotípica salidas de progresión de la enfermedad2,3. También se hacen grandes esfuerzos en el descubrimiento de fármacos y diseño para algunas de nuestras enfermedades más temidas generalizadas. Sin embargo, la evaluación de la relación entre genotipo, fenotipo, carga de placa amiloide y administración de la droga no es sencillo. Las herramientas para la coloración y la proyección de imagen de amiloide en el tejido son a menudo embotadas y proporcionan información de baja resolución sobre estructura y formación de amiloide.
Rojo Congo birrefringencia, ThT y ThS fluorescencia son ejemplos de los métodos clásicos de detección y análisis de carga amiloidea en muestras de tejido de biopsias de pacientes post mortem muestras y modelos animales de enfermedad4. Estas técnicas se han utilizado durante varias décadas (rojo Congo desde la década de 1920 y ThT y derivados desde la década de 1960), y aunque instrumentación ha sido refinada y permite el análisis detallado, los procedimientos de tinción y análisis todavía se están realizando de la misma manera que hace casi un siglo.
En este papel, describimos la utilización de un colorante amiloide novela altamente sensible, hFTAA5, que permite la detección de depósitos de proteína inmadura con alta precisión, así como la detección de amiloide madura. En comparación a los tintes convencionales, hFTAA ha demostrado detectar una amplia gama de enfermedades asociadas proteínas agregados5,6,7. Además, hFTAA puede aplicarse también para asignación óptica de distintos morfotipos agregados8. Adjunto, describimos hFTAA tinción y análisis de tejido establecidos modelos animales de enfermedad priónica y proteína precursora de amiloide-β (APP) ratones transgénicos diseñados para imitar el desarrollo de la placa en la enfermedad de Alzheimer9,10 . También mostramos post mortem muestras y análisis del diagnóstico de pacientes con amiloidosis sistémica. El LCOs tienen propiedades intrínsecas que les permite informar sobre las diferencias conformacionales dentro de una placa; y al combinar dos LCOs con diferentes propiedades en cuanto a encuadernación y fluorescencia, la diferencia es aún más pronunciada11. Un microscopio de epifluorescencia equipado con filtros de paso largo y una cabeza de cámara hiperespectral se utiliza para permitir la clasificación objetiva de las propiedades espectrales y grabación de imágenes para análisis espectral. Microscopía de fluorescencia confocal con un láser sintonizable como la fuente de excitación se utiliza para evaluar las propiedades tridimensionales de una placa amiloidea en mayor detalle. El láser sintonizable permite recopilación de espectro de excitación y un paso menos selección de longitudes de onda de emisión en el microscopio permite la proyección de imagen de fluorescencia LCO e inmunofluorescencia para determinar la localización de amiloide y de proteína diana. FLIM ofrece una sensibilidad sin precedentes a diferencias conformacionales impuestas el LCOs y revela las diferencias que podrían no detectarse en los espectros de emisión de fluorescencia.
Los principales objetivos con el método de tinción descrito son para facilitar la detección sensible de pequeños depósitos de amiloide y caracterizar conformacional del polimorfismo dentro de depósitos de amiloide. Este conocimiento es importante para la comprensión básica de enfermedades de agregación de la proteína.
Protocol
Representative Results
Discussion
Deposición de proteínas aberrantemente dobladas en amiloide es un evento clave de muchos procesos de enfermedad. Placas amiloides extracelulares compuesta de péptidos Aβ y Neurofibrilar intracelular formado por tau hiperfosforilada se encuentra en el cerebro de los pacientes de la enfermedad de Alzheimer. Una gama de diferentes proteínas, por ejemplo, transthyretin (TTR), componente de suero amiloide A (SAA) y misfold de cadena ligera de la IgG y manifiestan como depósitos de amiloide en los tejidos fuera del SNC. Aunque amiloide los depósitos han sido conocidos y estudiado por más de un siglo, todavía carecen de un conocimiento detallado de cómo amiloide deposición se inicia en el nivel molecular y qué se puede hacer para evitar este proceso. Para la enfermedad de Alzheimer, es necesario corroborar cómo el proceso de amiloidosis está asociado con la neurodegeneración. Una misión clave en la misión para tratar la amiloidosis es desarrollar novela perfeccionado herramientas para el seguimiento de amiloide iniciación, progresión y regresión; por lo tanto objetivo detección de amiloide es clave. A la larga, beneficiará a diagnóstico clínico del aumento de la sensibilidad y la selectividad de7,de métodos de tinción amiloide15. Desafíos actuales a este respecto son enormes y es un área de investigación muy activa. Un tema principal para el desarrollo clínico y ensayos es diagnóstico pronóstico. Estas enfermedades probablemente comienzan mucho antes de que aparezcan los síntomas, pero para comenzar con tratamiento allí debe ser la identificación de la enfermedad. Aquí, la sensibilidad es un aspecto clave para las nuevas metodologías. Además, este problema es más complejo porque algunos agregados de proteína son tóxicos, algunos son protectores, y algunos son neutros. Por lo tanto, la capacidad para monitorear morfotipos agregados específicos es esencial puesto que la existencia de distintas especies agregadas se ha sugerido para explicar el fenotipo heterogéneo para una diversidad de neurodegeneración de agregación de la proteína. Por ejemplo, la proteína del prión es un clásico ejemplo de cómo puede malpliegan una idéntica secuencia primaria de aminoácidos en distintos morfotipos agregados, que dan lugar a cepas priónicas específicos. Polimorfismo similar también se ha divulgado para el péptido Aβ, α-sinucleína y tau. En este sentido, LCOs han demostrado ser herramientas excepcionales para asignación óptica de distintos morfotipos agregados. Proteína del prión-cepa-específica agregados, depósitos de proteína encontrados en varios tipos de amiloidosis sistémica, así como polimórfica Aß y agregados de tau se han distinguido por el fenómeno óptico conformationally inducido desde el LCOs.
Deposición amiloidea es un evento que ocurre en los tejidos que son difíciles de penetrar con métodos bioquímicos o biofísicos de precisión molecular. La posibilidad de eventos ex vivo, en vivoy en vitro con las mismas moléculas LCO la sonda fija la etapa para desenredar los eventos que se producen en vivo con técnicas que solo son posibles de aplicar en ex vivo o en Vitro muestras de11,17. Un modelo estructural de alta resolución reciente muestra que la pentamérica LCO ALCA (pFTAA) se une en una cavidad formada por cadenas laterales alineadas paralelamente con el eje de la fibrilla que abarcan 6 beta-líneas paralelas en el registro18, demostrando que es posible tener un conocimiento de la resolución atómica sobre las entidades de destino OCV. En esencia el modo de la cavidad y enlace de pFTAA es similar al rojo de Congo19, dictado por una ranura alineado con repetitiva positiva cargada Lys-las cadenas laterales. La afinidad de LCOs parecen ser mejor en comparación con rojo Congo probablemente debido a la flexibilidad de la cadena y fuertes interacciones de van der Waals de los átomos de azufre de los anillos de tiofeno hacia la cavidad hidrófoba. La detección de especies prefibrillar (antes ThT responde)5,20 aparece dependiente en hojas β repetitivos, conformadas en el registro de URL beta de filamentos, que para hFTAA dos unidades de tiofeno más de pFTAA período de cruce de hasta 8 hilos de beta.
El protocolo de tinción requiere prestar atención a la resolución de problemas en los siguientes pasos: (i) la fijación: fijación extensa de muestras de tejido puede interrumpir la estructura amiloidea y limitar la posibilidad de detectar variación en espectros de fluorescencia inducidos por distorsión conformacional de la molécula de hFTAA. Fijación suave de cryosections del material congelado es preferida para lograr una óptima resolución espectral. Sin embargo, hFTAA de la mancha y amiloide en tejido fijo pero con menor eficacia y menos variación espectral de fluorescencia. (ii) método exposición: pre-tratamiento del tejido para lograr la exposición del epítopo para Unión de anticuerpos en ocasiones podría reducir la capacidad para hFTAA a enlazar debido interrumpió estructura amiloidea. Si este es un tema y exposición del epítopo es un paso crucial en el anticuerpo protocolo de tinción, secciones consecutivas de anticuerpo y hFTAA, respectivamente puede ser considerado. (iii) overstaining: hFTAA es extremadamente sensible. Soluciones de trabajo deben conservarse en concentración baja nM. Disminuir la concentración de hFTAA si la tinción de fondo es un problema. Si los elementos que se unen hFTAA son escasos en el tejido, un exceso de hFTAA puede Agregar y se acumulan en el medio de montaje. Esto es reconocido como la fluorescencia que no está en el plano de enfoque del propio tejido. Si esto aparece, sumerja el portaobjetos montado en PBS hasta el cubreobjetos se pueden deslizar de la sección, lavar con PBS y vuelva a montar con medio de montaje fresco y un cubreobjetos nuevo. (iv) filtro basado proyección de imagen: este papel describe imágenes de fluorescencia sobre todo espectral resueltas usando filtros de paso largo o varios canales de detección. hFTAA también puede controlarse mediante filtros de pase corto. Tenga en cuenta que esto reducirá el contraste y abolir las posibilidades para la detección de múltiples colores.
En los últimos años se ha hecho evidente que la investigación como herramientas, LCOs fluorescentes y en particular hFTAA muestran propiedades muy prometedoras. Resultados se han demostrado para una gran variedad de proteínas y Estados de la enfermedad, que van desde la detección de hFTAA de los agregados dentro de las células (tau, miositis por cuerpos de inclusión), amiloide sistémico de amiloide del suero A transthyretin, las cadenas ligeras de inmunoglobulina (kappa y lambda) seminogelin 1, prión proteína (incluyendo muestras clínicas)21, polipéptido amiloideo del islote e insulina7,15. Un factor limitante para la aplicación de hFTAA como una herramienta de diagnóstico es que eso microscopia de la fluorescencia no se utiliza ampliamente en los laboratorios de rutina patología amiloidea. Además, no es fácilmente disponible en la clínica. Sin embargo, hFTAA tinción amiloide y microscopía de fluorescencia han sido utilizados en laboratorios clínicos en un microscopio de fluorescencia basada en filtro y debeconsiderarse como un método complementario de diagnóstico. Esto fue demostrado recientemente en biopsias de síndrome del túnel carpiano con el amyloidosis de transthyretin básicos parámetros de fluorescencia en una manera automatizada22.
Además, además de varias proteínas, fluorescencia hFTAA reconoce una gran variedad de tipos de fibrilla y la fibrilares amiloides agregados p. ej., especies fibrilares de vía se han detectado y caracterizado. En esta publicación, hemos demostrado una OCV en distintos tipos de muestra utilizando tres técnicas de microscopía. El uso de la síntesis controlada también ha permitido el desarrollo de LCOs de detección versátil de dianas biomoleculares, por ejemplo, la grabación de interacciones de plasmón superficial (SPR) de resonancia23 y radiolabeling por emisión de positrones tomografía (PET)24.
Hasta la fecha, se han publicado más de 25 diferentes LCOs con. Un mayor uso de LCOs para obtener imágenes de depósitos amiloides aumentará el conocimiento y la comprensión de cómo estos agregados asociados a enfermedad de montan, desmontarán e interfieran con los órganos y personas en que residen.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a Mikael Lindgren y Chanan Sluzny asesoramiento en microscopía de fluorescencia y Adriano Aguzzi, Johan Bijzet, Bouke Hazenberg, Frank Heppner, Mathias Jucker, Therese Klingstedt, Karin Magnusson, Christina Sigurdson, Daniel Sjölander, Christoph Röcken, Gunilla Westermark, por Westermark y Kurt Zatloukal por su contribución a las secciones de tejido o micrografías mostradas en esta publicación. La colección de datos presentados en este documento ha sido financiada por las contribuciones de la Fundación sueca del cerebro (Hjärnfonden), la Asociación de Alzheimer sueco (Alzheimerfonden), el Consejo de investigación sueco (VR), la Asociación Göran Gustafsson, Georg & Astrid Olsson, proyecto UE FP7 salud LUPAS y Universidad de Linköping.
Materials
| hFTAA/Amytracker545 | Ebba Biotech | ||
| Dako fluorescene mounting medium | Agilent technologies | GM304 | |
| LeicaDM6000 | Leica | ||
| Lumen 200 | Prior | ||
| Spectraview system | ASI spectral imaging | ||
| Spectraview software | ASI spectral imaging | ||
| LSM780 | Zeiss | ||
| Zen 2010b v6.0 software | Zeiss | ||
| FLIM system | Becker & Hickl | ||
| Ar/ML 458/488/514 | Zeiss | ||
| Tunable Laser In Tune | Zeiss |
References
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