تصوير الأنسجة اميلويد ملطخة بالانارة أوليجوثيوفينيس مترافق بالفائقة الطيفية [كنفوكل] مجهرية والأسفار تصوير مدى الحياة
Summary
الترسب اميلويد هو السمة مميزة لأمراض مختلفة ويصيب الكثير من الأجهزة المختلفة. وتصف هذه الورقة تطبيق أوليجوثيوفيني مترافق الإنارة الفلورية تلطيخ في تركيبة مع تقنيات الفحص المجهري الأسفار. ويمثل هذا الأسلوب المصبوغة أداة قوية للكشف والتنقيب من المجاميع البروتين في الأجهزة السريرية والعلمية على حد سواء.
Abstract
البروتينات التي تودع اميلويد في الأنسجة في جميع أنحاء الجسم يمكن أن تكون سببا أو نتيجة لعدد كبير من الأمراض. ومن بين هذه نجد أمراض الأعصاب مثل مرض باركنسون والزهايمر التي تصيب أساسا الجهاز العصبي المركزي، والداء النشواني الجهازية حيث تودع اميلويد المصل A, ترانسثيريتين وسلاسل خفيفة مفتش اميلويد في الكبد، الرسغ النفق والطحال والكلى، والقلب والأنسجة الطرفية الأخرى. وقد تعرف اميلويد ودرس لأكثر من قرن، غالباً باستخدام الأصباغ اميلويد محددة مثل أحمر الكونغو وثيوفلافين تي (تي إتش تي) أو ثيوفلافين (ThS). في هذه الورقة، نقدم هيبتامير-فورميل حمض الخليك ثيوفين (هفتا) كمثال ليكمل وضعت مؤخرا إلى هذه الأصباغ تسمى أوليجوثيوفينيس مترافق الإنارة (لكوس). هفتا سهلة الاستخدام وهو متوافق مع تلطيخ شارك في الفلورة أو علامات أخرى الخلوية. بحوث مستفيضة أثبتت أن هفتا بالكشف عن طائفة أوسع من المجاميع البروتين الأمراض المرتبطة الأصباغ اميلويد التقليدية. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أيضا تطبيق هفتا الضوئية انتداب مورفوتيبيس مجمعة متميزة للسماح للدراسات المتعلقة بتعدد الأشكال فيبريل اميلويد. بينما التصوير المنهجية المطبقة اختيارية، ونحن هنا تثبت التصوير الطيفي (له)، ليزر المسح المجهري [كنفوكل] وعمر fluorescence التصوير (فليم). وتبين هذه الأمثلة بعض تقنيات التصوير حيث لكوس يمكن استخدامها كأدوات للحصول على معرفة أكثر تفصيلاً لتشكيل والخصائص الهيكلية أميلويدس. قيداً هاما لهذه التقنية، أما بالنسبة لجميع تقنيات الفحص المجهري الضوئي التقليدية، شرط الحجم المجهري للمجاميع للسماح بالكشف عن. وعلاوة على ذلك، ينبغي أن تشمل الإجمالي بنية بيتا-ورقة متكررة للسماح لربط هفتا. التعرض المفرط التثبيت و/أو حانمه أن تعديل الهيكل الإجمالي أو تكيف يمكن أن تجعل هفتا الفقيرة ملزمة وتشكل القيود المفروضة على التصوير بدقة ومن ثم.
Introduction
ترسب المادة النشوانية في الأنسجة السمة مميزة باثولوجي في عدد أمراض مثل مرض الزهايمر ومرض باركنسون، والداء النشواني النظمية وأمراض بريون. وعلى الرغم من انتشار الأمراض المرتبطة بالمادة النشوانية، وحقيقة أن ما يقرب من 40 من البروتينات المختلفة للتاريخ قد صنفت اميلويد السلائف في الإنسان1، يعرف الكثير عن العلاقة بين الترسيب اميلويد والمرض النمط الظاهري. علم الأنسجة للعينات المأخوذة من المرضى البشرية قد تم استخدامها سواء لأغراض التشخيص والعلمية. عدد كبير من النماذج الحيوانية قد أنشئت للتحقيق في العلاقة بين عبء اميلويد والسلوك ومدى الحياة وعدد من الآخرين قراءة المظهرية الرافضة للمرض تطور2،3. كما تبذل جهود كبيرة في اكتشاف الأدوية وتصميم لمكافحة بعض الأمراض على نطاق واسع يخشى معظم أعمالنا. ومع ذلك، تقييم العلاقة بين النمط الوراثي والنمط الظاهري، وتحميل البلاك اميلويد، والدواء ليس مستقيمة. أدوات التلوين والتصوير من اميلويد في الأنسجة غالباً ما تكون حادة وتوفير معلومات ذات الدقة المنخفضة على تشكيل اميلويد والهيكل.
إنكسار مزدوج أحمر الكونغو وتي إتش تي ThS الأسفار أمثلة الأساليب الكلاسيكية لكشف وتحليل عبء اميلويد في عينات الأنسجة من خزعات المريض وبعد الوفاة عينات ونماذج حيوانية للمرض4. وقد استخدمت هذه التقنيات لعدة عقود (أحمر الكونغو منذ العشرينات من القرن الماضي وتي إتش تي ومشتقاته منذ الستينات)، وعلى الرغم من أن الأجهزة وقد تم تنقيح ويسمح بتحليل مفصل، لا تزال قيد التنفيذ الإجراءات المصبوغة والتحليل بنفس الطريقة التي يعامل بها قبل قرن تقريبا.
في هذه الورقة، ويصف لنا الاستفادة من صبغة اميلويد رواية حساسة للغاية، هفتا5، التي تسمح الكشف عن رواسب صغير البروتين غير ناضج بدرجة عالية من الدقة، فضلا عن الكشف عن اميلويد ناضجة. ومقارنة بالأصباغ التقليدية، لقد أثبت هفتا للكشف عن مجموعة واسعة من الأمراض المرتبطة البروتين المجاميع5،،من67. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أيضا تطبيق هفتا للتعيين بصري مورفوتيبيس مجمعة مميزة8. وهنا، يمكننا وصف تلطيخ هفتا وتحليل الأنسجة من نماذج حيوانية المنشأة من المرض بريون وبيتا اميلويد السلائف البروتين (APP) الفئران المعدلة وراثيا مصممة لتقليد وضع اللوحة في مرض الزهايمر9،10 . نعرض أيضا تحليل للتشخيص وبعد الوفاة عينات من المرضى الذين يعانون من الداء النشواني النظامية. وقد لكوس الخصائص الجوهرية التي تمكنهم من الإبلاغ عن الاختلافات conformational داخل اللوحة واحدة؛ وعن طريق الجمع بين اثنين لكوس مع خصائص مختلفة فيما يتعلق بالأسفار والملزمة، أكثر وضوحاً الفارق11. مجهر ابيفلوريسسينسي مزودة بمرشحات تمرير طويل ويستخدم رأس كاميرا الفائقة الطيفية لتمكين تسجيل من ميكروجرافس للتحليل الطيفي وتصنيف موضوعي للخواص الطيفية. يستخدم مجهر الأسفار [كنفوكل] مع ليزر الانضباطي كمصدر للإثارة لتقييم الخصائص ثلاثية الأبعاد البلاك اميلويد بمزيد من التفصيل. ليزر الانضباطي يتيح جمع طيف الإثارة وخطوة أقل اختيار الأطوال الموجية الانبعاثات في المجهر يمكن تصوير المشارك لكو الأسفار والفلوره لتحديد المشارك الترجمة من البروتين المستهدف واميلويد. فليم يوفر حساسية لم يسبق لها مثيل للاختلافات كونفورماشونال المفروضة لكوس، ويكشف عن الخلافات التي قد لا يمكن الكشف عنها في أطياف الانبعاث الأسفار.
هي الأهداف الرئيسية مع أسلوب المصبوغة وصف لتيسير الكشف عن حساسية من رواسب اميلويد الصغيرة وتميز conformational التعدد داخل رواسب اميلويد. هذه المعرفة هامة لفهم أساسي لأمراض تجميع البروتين.
Protocol
Representative Results
Discussion
ترسب البروتينات أبيرانتلي مطوية في اميلويد حدثاً رئيسيا للعديد من الأمراض العمليات. لويحات اميلويد خارج الخلية تتألف من الببتيدات Aβ والتشابك نيوروفيبريلاري داخل الخلايا التي شكلتها تاو هايبرفوسفوريلاتيد توجد في المخ لمرضى الزهايمر. مجموعة من البروتينات المختلفة، مثلاً، ترانسثيريتين (بعد)، “اميلويد المصل” ألف عنصر (سا)، ومفتش السلسلة الخفيفة ميسفولد وبيان رواسب اميلويد في الأنسجة خارج الجهاز العصبي المركزي. على الرغم من أن اميلويد قد يعرف بالودائع ودرس لأكثر من قرن، ونحن لا تزال تفتقر إلى معرفة تفصيلية لكيفية اميلويد هو بدأ ترسب على المستوى الجزيئي، وما يمكن فعله لمنع هذه العملية. لمرض الزهايمر, ومن الضروري أن تثبت كيف ترتبط عملية الداء النشواني مع نيوروديجينيريشن. السعي مفتاح واحد في البعثة لعلاج الداء النشواني هو وضع رواية صقل أدوات لرصد بدء اميلويد، والتدرج، والانحدار؛ ومن ثم الكشف عن اميلويد المستهدف هو المفتاح. على المدى الطويل، التشخيص اﻻكلينيكي سوف تستفيد من زيادة الحساسية والانتقائية اميلويد المصبوغة أساليب7،15. التحديات الحالية في هذا الصدد هائلة، وهي منطقة أبحاث نشطة للغاية. إحدى المسائل الرئيسية للتطوير السريري والمحاكمات تشخيص تنبؤاتها. بدء هذه الأمراض المحتمل وذلك قبل ظهور الأعراض، ولكن يلزم للبدء بالعلاج هناك تحديد لهذا المرض. هذه الوثيقة، حساسية أحد جوانب رئيسية لمنهجيات جديدة. وعلاوة على ذلك، أن هذه المسألة أكثر تعقيداً لأن بعض المجاميع البروتين السامة، وبعضها واقية، وبعضها محايد. ومن ثم القدرة على رصد مورفوتيبيس المجمعة محددة أمر أساسي نظراً لوجود الأنواع مجمعة مميزة قد اقترح لشرح النمط الظاهري غير المتجانسة التي ذكرت لمجموعة متنوعة أمراض تجميع البروتين الأعصاب. على سبيل المثال، هو بروتين بريون مثال كلاسيكي لكيف يمكن ميسفولد تسلسل الأحماض الأمينية أساسية متطابقة في مورفوتيبيس التجميعية المميزة، التي تؤدي إلى سلالات بريون محددة. تعدد الأشكال مماثلة قد أبلغ أيضا عن الببتيد Aβ و α-سينوكلين تاو. وفي هذا الصدد، أظهرت لكوس لتكون أدوات المستحقة لإحالة بصري مورفوتيبيس مجمعة متميزة. بروتين بريون حدة السلالة المجاميع، ودائع البروتين الموجودة في عدة أنواع من الداء النشواني النظامية، فضلا عن Aβ متعددة الأشكال، وتم تمييز تاو المجاميع بسبب ظاهرة الضوئية المستحث كونفورماتيونالي ملاحظته من لكوس.
الترسب اميلويد هو حدث الذي يحدث في الأنسجة التي من الصعب اختراق مع الأساليب الفيزيائية أو الكيميائية الحيوية الجزيئية الدقة. إمكانية للتحقيق في أحداث السابقين فيفو فيفو، و في المختبر باستخدام الجزيئات لكو نفس يمهد الطريق لكشف الأحداث التي تحدث في فيفو استخدام التقنيات التي الوحيدة الممكنة لتطبيق على السابقين فيفو أو في المختبر عينات11،17. يظهر نموذج هيكلي دقة عالية تم الإبلاغ عنها مؤخرا أن بينتاميريك لكو فتا (بفتا) يربط في تجويف شكلت بمحاذاة الجانب سلاسل متوازية مع محور فيبريل تمتد 6 في سجل مواز بيتا-خيوط18، مما يدل على أنه ممكن اكتساب المعرفة القرار الذري عن الكيانات المستهدفة لكو. في جوهرها يشبه وضع تجويف وملزمة ملزمة بفتا أحمر الكونغو19، تمليها أخدود تصطف المتكررة إيجابية مشحونة ليز الجانب سلاسل. تقارب لكوس يبدو أفضل مقارنة بالأحمر الكونغو احتمالاً بسبب سلسلة من المرونة وقوى فإن دير فالس التفاعلات من ذرات الكبريت الخواتم ثيوفين نحو تجويف مسعور. الكشف عن أنواع بريفيبريلار (قبل يستجيب تي إتش تي)5،20 يظهر اعتماداً على أوراق β المتكررة، تتألف من بسجل مواز-بيتا-خيوط، الذي سيكون هفتا يجري وحدتين ثيوفين أطول من بفتا تمتد عبر معبر خيوط بيتا يصل إلى 8.
يتطلب البروتوكول المصبوغة بإيلاء الاهتمام لمشكلة إطلاق النار في الخطوات التالية: (ط) التثبيت: التثبيت واسعة من عينات الأنسجة يمكن أن يعطل هيكل اميلويد وتحد من إمكانية الكشف عن التباين في الأطياف fluorescence الناجمة عن كونفورماشونال تشويه للجزيء هفتا. ويفضل تثبيت خفيفة من كريوسيكشنز من المواد الطازجة المجمدة لتحقيق الدقة الطيفية المثلى. ومع ذلك، سوف هفتا وصمة عار وفلوريس اميلويد في الأنسجة الثابتة ولكن مع انخفاض كفاءة وأقل تباين الطيفية. (ثانيا) حانمه التعرض: المعالجة المسبقة للأنسجة لتحقيق حانمه التعرض لجسم ملزمة أحياناً قد تقلل قدرة هفتا لربط نظراً لتعطل هيكل اميلويد. إذا كان هذا مشكلة، والتعرض حانمه خطوة حاسمة في جسم تلطيخ البروتوكول، باستخدام مقاطع متتالية للأجسام المضادة وهفتا، على التوالي يمكن اعتبار. (ثالثا) أوفيرستاينينج: هفتا حساس للغاية. يجب أن تبقى الحلول العامل بتركيز منخفض شمال البحر الأبيض المتوسط. انخفاض تركيز هفتا إذا كان تلوين الخلفية مشكلة. إذا كانت العناصر التي تربط هفتا متفرق في الأنسجة، يمكن تجميع فائض هفتا وتتراكم في الأجلين المتوسط والتركيب. هذا هو معترف به الأسفار التي ليست في الطائرة التركيز من الأنسجة نفسها. إذا كان هذا يبدو، تزج الشريحة المحملة في برنامج تلفزيوني حتى يمكن أن ينزلق من القسم بكشف الغطاء ويغسل مع برنامج تلفزيوني وإعادة تحميلها مع تصاعد الطازجة المتوسطة وزلة غطاء جديد. (رابعا) عامل التصفية على أساس التصوير: تصف هذه الورقة حل معظمها طيفيا fluorescence التصوير باستخدام مرشحات تمرير طويل أو الكشف عن قنوات متعددة. ويمكن أيضا رصد هفتا استخدام مرشحات تمرير قصيرة. يرجى أن يكون على علم بأن هذا الحد من التباين وتلغي إمكانيات الكشف عن ألوان متعددة.
على مدى السنوات الماضية، أصبح من الواضح أن أدوات، لكوس فلوري البحث ولا سيما هفتا إظهار خصائص واعدة جداً. وقد أظهرت نتائج لمجموعة كبيرة متنوعة من البروتينات والحالات المرضية، تتراوح بين هفتا الكشف عن المجاميع داخل الخلايا (تاو، الهيئة إدراج التهاب العضل)، اميلويد الجهازية المصل اميلويد أ، ترانسثيريتين، وسلاسل خفيفة الغلوبولين المناعي (كابا و لامدا) سيمينوجيلين 1، بريون البروتين (بما في ذلك العينات السريرية)21، ببتيد اميلويد في جزيرة ليلى، والإنسولين7،15. عاملاً مقيداً لتنفيذ هفتا كأداة تشخيص المجهري الأسفار أن لا يستخدم على نطاق واسع في مختبرات علم الأمراض اميلويد الروتينية. وعلاوة على ذلك، له ليست متاحة بسهولة في العيادة. ولكن هفتا تلطيخ اميلويد ومجهرية الأسفار قد استخدمت في المختبرات السريرية في مجهر الأسفار استناداً إلى عامل تصفية وينبغيتعتبر طريقة تشخيص مجاني. وقد تجلى مؤخرا في النفق الرسغي خزعات مع الداء النشواني ترانسثيريتين باستخدام الإعدادات الأساسية للأسفار في أزياء الآلي22.
وعلاوة على ذلك، بالإضافة إلى البروتينات المختلفة، fluorescence هفتا تسلم مجموعة متنوعة واسعة من أنواع فيبريل ومجاميع اميلويد فيبريلار مسبقاً، مثلاً، تم الكشف عن مسار فيبريلار الأنواع وتتميز. في هذا المنشور، لقد أظهرنا لكو واحد على مختلف أنواع العينة باستخدام ثلاث تقنيات الفحص المجهري. كما أتاح استخدام التوليف التي تسيطر عليها لوضع لكوس للكشف تنوعاً من الأهداف الجزيئية البيولوجية، مثلتسجيل التفاعلات السطحية مأكل مثل الطحين الرنين (موارد البرنامج الخاصة)23 وراديولابيلينج لانبعاث بوزيترون تصوير شعاعي طبقي (محبوبة)24.
وحتى الآن، تم نشر ما يزيد على 25 لكوس مختلفة. زيادة استخدام لكوس لتصوير رواسب اميلويد ستزيد معرفة وفهم لكيفية تجميع هذه المجاميع المرتبطة بالمرض وتفكيكه وتتداخل مع الأجهزة والأفراد التي يقيمون فيها.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب نود أن نشكر ليندغرين ميكائيل وسلوزني شأنا لإسداء المشورة بشأن الفحص المجهري الأسفار، وادريانو اغوزي، يوهان بيجزيت، حزينبيرج بوك، هيبنير فرانك، جاكر ماتياس، تيريز كلينجشتات، ماجنوسون كارين، كريستينا سيجوردسون، دانيال Sjölander، كريستوف Röcken، ويستيرمارك غونيلا، الواحدة ويستيرمارك، وكورت زاتلوكال للمساهمة في أقسام الأنسجة أو ميكروجرافس المعروضة في هذا المنشور. وتم تمويل جمع البيانات المعروضة في هذه الوثيقة بمساهمات “المؤسسة السويدية في الدماغ” (Hjärnfonden)، جمعية “الزهايمر السويدية” (الزيميرفوندين)، ومجلس البحوث السويدية (VR)، الرابطة غوستافسون غوران، غيورغ & أستريد أولسون، ومشروع “الاتحاد الأوروبي FP7 الصحة” لوباس، وجامعة ينكوبينج.
Materials
| hFTAA/Amytracker545 | Ebba Biotech | ||
| Dako fluorescene mounting medium | Agilent technologies | GM304 | |
| LeicaDM6000 | Leica | ||
| Lumen 200 | Prior | ||
| Spectraview system | ASI spectral imaging | ||
| Spectraview software | ASI spectral imaging | ||
| LSM780 | Zeiss | ||
| Zen 2010b v6.0 software | Zeiss | ||
| FLIM system | Becker & Hickl | ||
| Ar/ML 458/488/514 | Zeiss | ||
| Tunable Laser In Tune | Zeiss |
References
- Sipe, J. D., et al. Amyloid fibril proteins and amyloidosis: chemical identification and clinical classification International Society of Amyloidosis 2016 Nomenclature Guidelines. Amyloid. 23, 209-213 (2016).
- Buxbaum, J. N. Animal models of human amyloidoses: are transgenic mice worth the time and trouble?. FEBS letters. 583, 2663-2673 (2009).
- Hall, A. M., Roberson, E. D. Mouse models of Alzheimer’s disease. Brain Res Bull. 88, 3-12 (2012).
- Westermark, G. T., Johnson, K. H., Westermark, P. Staining methods for identification of amyloid in tissue. Methods in enzymology. , 3-25 (1999).
- Klingstedt, T., et al. Synthesis of a library of oligothiophenes and their utilization as fluorescent ligands for spectral assignment of protein aggregates. Org Biomol Chem. 9, 8356-8370 (2011).
- Klingstedt, T., et al. Luminescent conjugated oligothiophenes for sensitive fluorescent assignment of protein inclusion bodies. Chembiochem. 14, 607-616 (2013).
- Sjolander, D., et al. Establishing the fluorescent amyloid ligand h-FTAA for studying human tissues with systemic and localized amyloid. Amyloid. 23, 98-108 (2016).
- Magnusson, K., et al. Multimodal fluorescence microscopy of prion strain specific PrP deposits stained by thiophene-based amyloid ligands. Prion. 8, 319-329 (2014).
- Radde, R., et al. Abeta42-driven cerebral amyloidosis in transgenic mice reveals early and robust pathology. EMBO Rep. 7, 940-946 (2006).
- Sturchler-Pierrat, C., et al. Two amyloid precursor protein transgenic mouse models with Alzheimer disease-like pathology. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 13287-13292 (1997).
- Nystrom, S., et al. Evidence for age-dependent in vivo conformational rearrangement within Abeta amyloid deposits. ACS chemical biology. 8, 1128-1133 (2013).
- Aslund, A., et al. Novel pentameric thiophene derivatives for in vitro and in vivo optical imaging of a plethora of protein aggregates in cerebral amyloidoses. ACS chemical biology. 4, 673-684 (2009).
- Nilsson, K. P., Herland, A., Hammarstrom, P., Inganas, O. Conjugated polyelectrolytes: conformation-sensitive optical probes for detection of amyloid fibril formation. Biochemistry. 44, 3718-3724 (2005).
- Mahajan, V., et al. Cross beta-sheet conformation of keratin 8 is a specific feature of Mallory-Denk bodies compared with other hepatocyte inclusions. Gastroenterology. 141, 1080-1090 (2011).
- Sjolander, D., Bijzet, J., Hazenberg, B. P., Nilsson, K. P., Hammarstrom, P. Sensitive and rapid assessment of amyloid by oligothiophene fluorescence in subcutaneous fat tissue. Amyloid. 22, 19-25 (2015).
- Arja, K., et al. Enhanced fluorescent assignment of protein aggregates by an oligothiophene-porphyrin-based amyloid ligand. Macromol Rapid Commun. 34, 723-730 (2013).
- Psonka-Antonczyk, K. M., et al. Nanoscale Structure and Spectroscopic Probing of Abeta1-40 Fibril Bundle Formation. Front Chem. 4, 44 (2016).
- Herrmann, U. S., et al. Structure-based drug design identifies polythiophenes as antiprion compounds. Sci Transl Med. 7, 299ra123 (2015).
- Schutz, A. K., et al. The amyloid-Congo red interface at atomic resolution. Angewandte Chemie (International ed). 50 (26), 5956-5960 (2011).
- Hammarstrom, P., et al. A fluorescent pentameric thiophene derivative detects in vitro-formed prefibrillar protein aggregates. Biochemistry. 49, 6838-6845 (2010).
- CORDIS. . Final Report Summary – LUPAS (Luminescent polymers for in vivo imaging of amyloid signatures). , (2013).
- Hahn, K., et al. Establishing and validating the fluorescent amyloid ligand h-FTAA (heptamer formyl thiophene acetic acid) to identify transthyretin amyloid deposits in carpal tunnel syndrome. Amyloid. , 1-9 (2017).
- Johansson, L. B., et al. An azide functionalized oligothiophene ligand–a versatile tool for multimodal detection of disease associated protein aggregates. Biosens Bioelectron. 63, 204-211 (2015).
- Nordeman, P., et al. (11)C and (18)F Radiolabeling of Tetra- and Pentathiophenes as PET-Ligands for Amyloid Protein Aggregates. ACS Med Chem Lett. 7, 368-373 (2016).
