הדמיה עמילואיד ברקמות מוכתם Oligothiophenes מצומדת זורח על ידי היפרספקטרליות קונאפוקלית מיקרוסקופ והדמיה שלמים קרינה פלואורסצנטית
Summary
התצהיר עמילואיד מהווה סימן היכר של מחלות שונות, פוגעת באיברים שונים רבים. מאמר זה מתאר את היישום של זריחה oligothiophene מצומדת זורח מכתים בשילוב עם טכניקות במיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית. שיטה זו מכתימים מייצגת כלי רב עוצמה עבור זיהוי וחקירה של אגרגטים חלבון ב setups קליניים ומדעיים.
Abstract
חלבונים להפקיד עמילואיד ברקמות בגוף יכולה להיות הגורם או התוצאה של מספר רב של מחלות. בין אלה אנו מוצאים מחלות ניווניות כגון מחלת אלצהיימר ופרקינסון מתעצמת בעיקר על מערכת העצבים המרכזית, וכן עמילואידוזיס מערכתית היכן להפקיד סרום עמילואיד A, transthyretin ו- IgG שרשראות אור כמו עמילואיד בכבד, שורש כף היד המנהרה הטחול, כליות, לב, רקמות היקפיים אחרים. עמילואיד ידוע והוא למד במשך יותר ממאה, לעתים קרובות תוך שימוש עמילואיד צבעים ספציפיים כגון אדום קונגו, Thioflavin T (ThT) או Thioflavin (ThS). בנייר זה, אנו מציגים חומצה אצטית thiophene heptamer-formyl (hFTAA) כדוגמה שפותחו לאחרונה שישלימו את התמונה אלה צבעי בשם oligothiophenes מצומדת זורח (LCOs). hFTAA הוא קל לשימוש, והוא תואם עם צביעת משותפת ב- immunofluorescence או עם סמנים אחרים התאית. מחקר מקיף הוכיחה ש-hftaa הזה מזהה מגוון רחב יותר של מחלות הקשורות אגרגטים חלבון מאשר צבעי עמילואיד קונבנציונלי. בנוסף, ניתן להחיל hFTAA גם עבור הקצאה אופטי של morphotypes צבור ברורים כדי לאפשר מחקרים של פולימורפיזם עמילואיד fibril. בעוד המתודולוגיה הדמיה חלה היא אופציונלית, אנחנו כאן מדגימים הדמיה היפרספקטרליות לחישה מרחוק (שלו), לייזר סריקה מיקרוסקופיה קונפוקלית ואורך חיים פלורסצנטיות הדמיה (FLIM). דוגמאות אלה להראות חלק טכניקות הדימות שבו LCOs יכול לשמש ככלים כדי לקבל מידע מפורט יותר על היווצרות ומאפיינים מבניים של amyloids. מגבלה חשובה הטכניקה היא, באשר כל טכניקות מיקרוסקופ אופטי קונבנציונאלי, הדרישה לגודל מיקרוסקופי של אגרגטים כדי לאפשר זיהוי. יתר על כן, שסך כל צריך מהווים מבנה β-גיליון החוזרות על עצמן כדי לאפשר hFTAA מחייב. חשיפה מוגזמת קיבוע ו/או epitope המשנים את מבנה צבירה או קונפורמציה ניתן לעיבוד איגוד hFTAA המסכן, ומכאן להוות המגבלות דימות מדויק.
Introduction
בתצהיר של עמילואיד ברקמות מהווה סימן היכר פיפטות מספר מחלות כגון מחלת אלצהיימר, מחלת פרקינסון, עמילואידוזיס מערכתית ומחלות פריון. למרות השכיחות של מחלות הקשורות עמילואיד, ואת העובדה כי קרוב 40 חלבונים שונים לתאריך שסווגו כמודעות מבשרי עמילואיד האנושי1, מעט מאוד ידוע על הקשר בין התצהיר עמילואיד פנוטיפ המחלה. היסטולוגיה של דגימות מחולים האנושי עבר לשמש הן למטרות אבחון ומדעיים. מספר רב של מודלים בעלי חיים הוקמו כדי לחקור את הקשר בין נטל עמילואיד, התנהגות, תוחלת החיים, לבין מספר אחר לקריאה פנוטיפי מגזרות של המחלה-התקדמות-2,–3. גם נעשים מאמצים גדולים גילוי תרופות ועיצוב לקרב כמה מחלות נרחבת המפחידים ביותר שלנו. עם זאת, הערכת הקשר בין גנוטיפ, פנוטיפ, טען פלאק עמילואיד, והתרופות אינו ישר קדימה. הכלים עבור צביעת והדמיה של עמילואיד ברקמות לעיתים בוטה, לספק מידע ברזולוציה נמוכה על היווצרות עמילואיד ומבנה.
קונגו אדום שבירה כפולה, ThT ו- ThS פלורסצנטיות הן דוגמאות קלאסיות שיטות זיהוי וניתוח עמילואיד נטל דגימות רקמה של ביופסיות החולה ופוסט מורטם דגימות, מודלים חייתיים של מחלות4. טכניקות אלה שימשו במשך כמה עשורים (קונגו האדום מאז שנות ה-20, ThT ונגזרות, מאז שנות ה-60), למרות מכשור שוכללה מאפשר ניתוח מפורט, ניתוח וקביעת נהלים מכתימים עדיין מבוצעות באותו אופן כמו כמעט לפני מאה שנה.
בנייר זה, אנו מתארים את הניצול של צבע רגישה מאוד עמילואיד הרומן, hFTAA5, המאפשר את איתור הפיקדונות חלבון לא בוגר קטן עם רמת דיוק גבוהה, וכן זיהוי של עמילואיד בוגרת. לעומת צבעים המקובלת, hFTAA הוכח כדי לזהות מגוון רחב יותר של מחלות הקשורות חלבון אגרגטים5,6,7. בנוסף, ניתן להחיל hFTAA גם עבור הקצאה אופטי של morphotypes צבור ברורים8. במסמך זה, אנו מתארים hFTAA מכתים וניתוח של רקמה מתוך ויצר מודלים חייתיים של מחלת פריאון ו עמילואיד-β קודמן חלבון (APP) העכברים הטרנסגניים שנועדו לחקות את התפתחות הפלאק אלצהיימר9,10 . אנו גם מראים ניתוח של האבחון, פוסט מורטם דגימות מחולים הסובלים עמילואידוזיס מערכתית. LCOs יש מאפיינים מהותיים מאפשר להם לדווח על הבדלים הסתגלותי בתוך רובד אחד; על ידי שילוב שתי LCOs עם מאפיינים שונים לגבי איגוד פלורסצנטיות, ההבדל בולטת אף יותר11. מיקרוסקופ epifluorescence מצויד זמן לעבור מסננים ומשמש ראש המצלמה היפרספקטרליות כדי לאפשר סיווג אובייקטיבי של תכונות ספקטרליות ורישום של micrographs עבור ניתוח ספקטרלי. מיקרוסקופ קונפוקלי זריחה עם לייזר tunable כמקור עירור משמש כדי להעריך את מאפייני תלת-ממדי פלאק עמילואיד בפירוט רב יותר. הלייזר tunable מאפשרת איסוף של עירור ספקטרום, צעד פחות מבחר של אורכי גל פליטה על המיקרוסקופ מאפשר הדמיה שותף לקו פלורסצנטיות, immunofluorescence לקבוע שיתוף לוקליזציה של חלבונים היעד, עמילואיד. FLIM מציע חסרת תקדים רגישות להבדלים הסתגלותי המוטלות על LCOs, מגלה הבדלים זה אולי לא יזוהו על ספקטרום הפליטה זריחה.
המטרות העיקריות עם השיטה מכתימים שתואר הן כדי להקל על זיהוי רגיש של משקעי עמילואיד קטן כדי לאפיין פולימורפיזם הסתגלותי בתוך משקעי עמילואיד. ידע זה חשוב על ההבנה הבסיסית של החלבון צבירת מחלות.
Protocol
Representative Results
Discussion
בתצהיר של חלבונים aberrantly מקופל לתוך עמילואיד הוא אירוע מפתח של תהליכי מחלה רבים. חוץ-תאית פלאק עמילואיד המורכב Aβ פפטידים, תאיים קשרים neurofibrillary הנוצרת על-ידי hyperphosphorylated טאו נמצאים במוח של חולי אלצהיימר. מגוון של חלבונים שונים, למשל, transthyretin (TTR), סרום עמילואיד A רכיב (SAA), ו- IgG שרשרת אור misfold מניפסט כמו משקעי עמילואיד ברקמות מחוץ מערכת העצבים. למרות עמילואיד פיקדונות ידוע ולמד במשך יותר ממאה, עדיין חסר מידע מפורט על איך עמילואיד התצהיר מאותחלת ברמה המולקולרית, מה ניתן לעשות כדי למנוע את התהליך הזה. עבור מחלת אלצהיימר, זה הכרחי לאמת איך התהליך של עמילואידוזיס משויך הקשורים ניוון מוחיים. המסע מפתח אחד במשימה בעמילואידוזיס הוא לפתח רומן יסודי כלי לניטור חניכה עמילואיד, התקדמות, רגרסיה; ומכאן זיהוי עמילואיד יישוב הוא המפתח. בטווח הארוך, אבחון קליני יהנה להגדיל את הרגישות ואת סלקטיביות של עמילואיד מכתימים שיטות7,15. אתגרים עכשוויים בהקשר זה הן אדירות, והוא תחום מחקרי מאוד פעיל. בעיה אחת הראשי עבור הפיתוח הקליני של ניסויים הוא אבחון prognostic. מחלות אלו סביר להתחיל הרבה לפני הופעת התסמינים, אך להתחיל עם טיפול שם צריך להיות זיהוי של המחלה. במסמך זה, רגישות הוא היבט מרכזי עבור הרומן מתודולוגיות. יתר על כן, בנושא זה אפילו יותר מורכב, כי כמה אגרגטים חלבון רעיל, חלקם מגן, וחלקן נייטרלי. ומכאן היכולת לפקח ספציפי morphotypes צבור חיוני מאז קיומו של מינים צבורים ברורים הוצע להסביר את פנוטיפ הטרוגנית דיווח עבור מגוון של מחלות ניווניות חלבון צבירה. למשל, חלבון פריאון הוא דוגמה קלאסית של איך רצף ראשי זהה של חומצות אמינו יכול misfold לתוך morphotypes צבירה שונים, אשר להצמיח זנים מסוימים פריון. פולימורפיזם דומה גם דווח פפטיד, α-synuclein של טאו Aβ. בהקשר זה, LCOs הוכחו להיות יוצאת דופן כלי להקצאת אופטי morphotypes צבורים שונים. אגרגטים חלבון פריאון-זן-ספציפי, משקעי חלבון נמצאו מספר סוגים של עמילואידוזיס מערכתית, כמו גם Aβ רב שלבית, אגרגטים טאו כיבדתם עקב התופעה אופטי conformationally המושרה הבחינו מפני LCOs.
התצהיר עמילואיד הוא אירוע אשר מתרחש ברקמות שקשה לחדור עם שיטות ביוכימיות או ביופיזיקלי של דיוק מולקולרי. האפשרות לחקור את האירועים שמחוץ ויוו, במבחנה באמצעות מולקולות לקו אותו קובע את הבמה עבור unraveling אירועים שמתרחשים ויוו באמצעות טכניקות אפשריות רק להחיל על שמחוץ או חוץ גופית דוגמאות11,17. המודל המבני ברזולוציה גבוהה דיווחו לאחרונה מראה כי pentameric לקו הסכם הסחר החופשי (pFTAA) נקשר בתוך חלל הנוצרת על-ידי מיושר לצד רשתות במקביל לציר fibril המתפרסות על-פני 6 ברישום בטא-רצחניים18, להפגין שזה ניתן להשיג ברזולוציה אטומית ידע על הישויות של המטרה לקו. בעיקרו של דבר מחייב חלל ואיגוד המצב של pFTAA דומה קונגו אדום19, מוכתבת על ידי חריץ שלאורכו חוזרות חיובי טעונה Lys לצד רשתות. זיקתו של LCOs להופיע כדאי להשוות לאדום קונגו, ככל הנראה בגלל הגמישות שרשרת ואינטראקציות ואן דר Waals חזקה של אטומי גופרית שר הטבעות thiophene לעבר חלל הידרופובי. זיהוי מינים prefibrillar (לפני ThT מגיב)5,20 מופיע תלויים גליונות β החוזרות על עצמן, מורכב, את הרישום במקביל-בטא-גדילי, אשר עבור hFTAA להיות שתי יחידות thiophene יותר pFTAA היה span ההיצטלבות של תחנה של גדילי-ביתא עד 8.
פרוטוקול מכתימים דורש תשומת לב צרות הירי על השלבים הבאים: (i) קיבעון: קיבוע נרחב של דגימות רקמה יכול לשבש את מבנה עמילואיד ולהגביל את האפשרות לזהות וריאציה פלורסצנטיות spectra שנגזרות עיוות הסתגלותי של מולקולת hFTAA. קיבוע מתון של cryosections מחומר קפוא טרי הוא העדיף כדי להשיג רזולוציה מיטבית ספקטרלי. עם זאת, hFTAA כתם, לזרוח עמילואיד ברקמות קבוע אבל עם יעילות מופחתת ופחות וריאציה ספקטרלי. (ii) Epitope חשיפה: טיפול קדם של רקמות כדי להשיג חשיפה epitope עבור הנוגדן מחייב לעיתים עלול להפחית את היכולת של hFTAA לאגד בגלל שיבשו מבנה עמילואיד. אם בעיה זו קיימת חשיפה epitope היא שלב קריטי הנוגדן מכתים פרוטוקול, באמצעות מקטעים רציפים עבור נוגדן hFTAA, בהתאמה יכול להיחשב. (iii) overstaining: hFTAA רגיש ביותר. פתרונות עבודה יש לשמור על ריכוז נמוך ננומטר. להקטין את הריכוז של hFTAA אם רקע מכתימה את הבעיה. אם רכיבי איגוד hFTAA הם דלילים ברקמה, עודף של hFTAA ניתן לצבור, להצטבר המדיום הרכבה. זה מזוהה כמו זריחה שאינו במישור המוקד של הרקמה עצמה. אם זה מופיע, לטבול את השקופית נטען ב- PBS עד בתגית הכיסוי יכול להיות החליקה של המקטע, לשטוף עם PBS, טען מחדש עם הרכבה טריים בינונית, תגית כיסוי חדש. (iv) מסנן בהתבסס הדמיה: מאמר זה מתאר פלורסצנטיות בעיקר spectrally נפתרה הדמיה באמצעות זמן לעבור מסננים או איתור ערוצים מרובים. hFTAA יכול גם להיות במעקב שימוש במסננים מסירה קצרה. שימו לב כי זה להפחית את החדות, לבטל את האפשרויות כדי לזהות צבעים מרובים.
במהלך השנים האחרונות זה הפך ברור כמו מחקר כלים, פלורסנט LCOs בפרט hFTAA להציג מאפיינים מאוד מבטיח. תוצאות הוכחו למגוון העצום של חלבונים ועם מצבי מחלה, החל hFTAA זיהוי של אגרגטים בתוך תאים (טאו, לומבגו הכללה הגוף), עמילואיד מערכתית של עמילואיד סרום A, transthyretin, שרשראות אור אימונוגלובולינים (לקאפה ו למדא) seminogelin 1, פריון חלבון (כולל דוגמאות קליניות)21, איון מפוליפפטיד עמילואיד ואינסולין7,15. גורם מגביל את יישום hFTAA ככלי אבחוני היא שמיקרוסקופ פלורסצנטיות הזה לא משמש בהרחבה במעבדות פתולוגיה עמילואיד שגרתית. יתר על כן, שלו אינה זמינה במרפאה. עם זאת, מכתים עמילואיד hFTAA, פלורסצנטיות מיקרוסקופ שימשו במעבדות קליניות במיקרוסקופ מסנן קרינה פלואורסצנטית מבוסס, צריךלהיחשב כשיטת אבחון ללא תשלום. זה הודגם לאחרונה על מנהרת שורש כף היד ביופסיות עם עמילואידוזיס transthyretin באמצעות הגדרות בסיסיות עבור זריחה אופנה אוטומטיות22.
יתר על כן, בנוסף חלבונים שונים, זריחה hFTAA מזהה מגוון עצום של סוגי fibril, אגרגטים עמילואיד fibrillar מראש, למשל, מסלול fibrillar מינים יש כבר זוהה מאופיין. בפרסום זה, הראו לקו אחד בסוגים שונים של דגימה באמצעות שלוש טכניקות במיקרוסקופ. השימוש של סינתזה מבוקר גם איפשר לפיתוח LCOs רב-תכליתי גילוי של יעדים למערכות ביולוגיות, למשל, הקלטה של אינטראקציות על ידי משטח פלזמון תהודה (SPR)23 של radiolabeling עבור פליטת פוזיטרון פוזיטרונים (PET)24.
נכון להיום, מעל 25 LCOs שונים עם פורסמו. שימוש מוגבר של LCOs עבור הדמיה של משקעי עמילואיד יגדיל את הידע ואת ההבנה של איך אלה הקשורים למחלה להרכיב, לפרק, אגרגטים להפריע האיברים ויחידים שבו הם מתגוררים.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצים להודות מיקאל לינדגרן, חנן Sluzny לקבלת ייעוץ אודות מיקרוסקופ פלורסצנטיות, ולא אדריאנו Aguzzi, יוהן Bijzet, Bouke Hazenberg, פרנק Heppner, מתיאס Jucker, Klingstedt תרז, קארין מגנוסון, כריסטינה עורכת הדין, דניאל Sjölander, כריסטוף Röcken, Gunilla Westermark, Westermark לכל ו קורט Zatloukal לתרומת רקמה מקטעים או micrographs המוצגים בפרסום זה. האוסף של נתונים שהוצגו במסמך זה יש כבר במימון תרומות של המוח שבדי קרן (Hjärnfonden), איגוד האלצהיימר שבדי (Alzheimerfonden), שוודית המועצה למחקר (VR), האגודה גוראן Gustafsson, גאורג & אסטריד אולסון, האיחוד האירופי האיחוד FP7 בריאות פרויקט LUPAS, ואוניברסיטת Linköping.
Materials
| hFTAA/Amytracker545 | Ebba Biotech | ||
| Dako fluorescene mounting medium | Agilent technologies | GM304 | |
| LeicaDM6000 | Leica | ||
| Lumen 200 | Prior | ||
| Spectraview system | ASI spectral imaging | ||
| Spectraview software | ASI spectral imaging | ||
| LSM780 | Zeiss | ||
| Zen 2010b v6.0 software | Zeiss | ||
| FLIM system | Becker & Hickl | ||
| Ar/ML 458/488/514 | Zeiss | ||
| Tunable Laser In Tune | Zeiss |
References
- Sipe, J. D., et al. Amyloid fibril proteins and amyloidosis: chemical identification and clinical classification International Society of Amyloidosis 2016 Nomenclature Guidelines. Amyloid. 23, 209-213 (2016).
- Buxbaum, J. N. Animal models of human amyloidoses: are transgenic mice worth the time and trouble?. FEBS letters. 583, 2663-2673 (2009).
- Hall, A. M., Roberson, E. D. Mouse models of Alzheimer’s disease. Brain Res Bull. 88, 3-12 (2012).
- Westermark, G. T., Johnson, K. H., Westermark, P. Staining methods for identification of amyloid in tissue. Methods in enzymology. , 3-25 (1999).
- Klingstedt, T., et al. Synthesis of a library of oligothiophenes and their utilization as fluorescent ligands for spectral assignment of protein aggregates. Org Biomol Chem. 9, 8356-8370 (2011).
- Klingstedt, T., et al. Luminescent conjugated oligothiophenes for sensitive fluorescent assignment of protein inclusion bodies. Chembiochem. 14, 607-616 (2013).
- Sjolander, D., et al. Establishing the fluorescent amyloid ligand h-FTAA for studying human tissues with systemic and localized amyloid. Amyloid. 23, 98-108 (2016).
- Magnusson, K., et al. Multimodal fluorescence microscopy of prion strain specific PrP deposits stained by thiophene-based amyloid ligands. Prion. 8, 319-329 (2014).
- Radde, R., et al. Abeta42-driven cerebral amyloidosis in transgenic mice reveals early and robust pathology. EMBO Rep. 7, 940-946 (2006).
- Sturchler-Pierrat, C., et al. Two amyloid precursor protein transgenic mouse models with Alzheimer disease-like pathology. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 13287-13292 (1997).
- Nystrom, S., et al. Evidence for age-dependent in vivo conformational rearrangement within Abeta amyloid deposits. ACS chemical biology. 8, 1128-1133 (2013).
- Aslund, A., et al. Novel pentameric thiophene derivatives for in vitro and in vivo optical imaging of a plethora of protein aggregates in cerebral amyloidoses. ACS chemical biology. 4, 673-684 (2009).
- Nilsson, K. P., Herland, A., Hammarstrom, P., Inganas, O. Conjugated polyelectrolytes: conformation-sensitive optical probes for detection of amyloid fibril formation. Biochemistry. 44, 3718-3724 (2005).
- Mahajan, V., et al. Cross beta-sheet conformation of keratin 8 is a specific feature of Mallory-Denk bodies compared with other hepatocyte inclusions. Gastroenterology. 141, 1080-1090 (2011).
- Sjolander, D., Bijzet, J., Hazenberg, B. P., Nilsson, K. P., Hammarstrom, P. Sensitive and rapid assessment of amyloid by oligothiophene fluorescence in subcutaneous fat tissue. Amyloid. 22, 19-25 (2015).
- Arja, K., et al. Enhanced fluorescent assignment of protein aggregates by an oligothiophene-porphyrin-based amyloid ligand. Macromol Rapid Commun. 34, 723-730 (2013).
- Psonka-Antonczyk, K. M., et al. Nanoscale Structure and Spectroscopic Probing of Abeta1-40 Fibril Bundle Formation. Front Chem. 4, 44 (2016).
- Herrmann, U. S., et al. Structure-based drug design identifies polythiophenes as antiprion compounds. Sci Transl Med. 7, 299ra123 (2015).
- Schutz, A. K., et al. The amyloid-Congo red interface at atomic resolution. Angewandte Chemie (International ed). 50 (26), 5956-5960 (2011).
- Hammarstrom, P., et al. A fluorescent pentameric thiophene derivative detects in vitro-formed prefibrillar protein aggregates. Biochemistry. 49, 6838-6845 (2010).
- CORDIS. . Final Report Summary – LUPAS (Luminescent polymers for in vivo imaging of amyloid signatures). , (2013).
- Hahn, K., et al. Establishing and validating the fluorescent amyloid ligand h-FTAA (heptamer formyl thiophene acetic acid) to identify transthyretin amyloid deposits in carpal tunnel syndrome. Amyloid. , 1-9 (2017).
- Johansson, L. B., et al. An azide functionalized oligothiophene ligand–a versatile tool for multimodal detection of disease associated protein aggregates. Biosens Bioelectron. 63, 204-211 (2015).
- Nordeman, P., et al. (11)C and (18)F Radiolabeling of Tetra- and Pentathiophenes as PET-Ligands for Amyloid Protein Aggregates. ACS Med Chem Lett. 7, 368-373 (2016).
