Imaging амилоида тканей витражи с светящиеся конъюгированных Oligothiophenes путем использования гиперспектральных конфокальная микроскопия и флуоресценции жизни изображений
Summary
Амилоидоподобные осаждения является отличительной чертой различных заболеваний и затрагивает множество различных органов. Этот документ описывает применение люминесцентных конъюгированных oligothiophene флуоресценции пятнать в сочетании с методами микроскопии флуоресцирования. Этот метод окрашивания представляет собой мощный инструмент для обнаружения и исследования белков агрегатов в клинических и научных установок.
Abstract
Белки, которые депозит как амилоида в тканях по всему телу может быть причиной или следствием большого числа заболеваний. Среди них мы находим нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера и Паркинсона болезнь, страдает прежде всего центральной нервной системы и системных амилоидоза, где амилоид A сыворотки, Транстиретин и легкие цепи IgG депозит как амилоида в печени, Кистевой туннель, селезенки, почек, сердца и других периферических тканей. Амилоид известны и изучены для более чем столетие, часто с использованием амилоида конкретных красителей, например красный Конго и Тиофлавин Т (ThT) или Тиофлавин (ThS). В этой статье мы представляем гептамер формил Тиофен уксусной кислоты (hFTAA) в качестве примера недавно разработанных дополняет эти красители, называется светящиеся конъюгированных oligothiophenes (LCOs). hFTAA проста в использовании и совместима с совместно окрашивание иммунофлюоресценции или других клеточных маркеров. Обширные исследования доказали, что hFTAA обнаруживает более широкий спектр болезни связанные белком агрегатов, чем обычные амилоида красители. Кроме того hFTAA также может применяться для оптического назначения различных агрегированных Морфотипы разрешить исследования амилоида фибриллярных полиморфизма. В то время как изображений методология не является обязательным, мы здесь продемонстрировать гиперспектральных изображений (HIS), лазерная сканирующая конфокальная микроскопия и флуоресценции жизни изображений (FLIM). Эти примеры показывают некоторые методы обработки изображений, где LCOs может использоваться как инструменты, чтобы получить более подробные сведения о формировании и структурные свойства Амилоиды. Является важным ограничением в технику, для всех обычных оптической микроскопии методы, требование для микроскопические размеры агрегатов разрешить обнаружение. Кроме того агрегат должен состоять из повторяющихся β-лист структуры для привязки hFTAA. Чрезмерной фиксации и/или эпитоп экспозиции, что изменить статистическую структуру или конформации можно сделать бедных hFTAA привязки и таким образом создают ограничения для точных изображений.
Introduction
Отложение амилоида в ткани является патологическим отличительной в число заболеваний, как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, амилоидоз системный и прионы заболеваний. Несмотря на распространенность заболеваний, связанных с амилоид и тот факт, что почти 40 различных белков до настоящего времени были классифицированы как амилоида прекурсоров в человека1мало что известно о связи между амилоида осаждения и болезни фенотип. Гистология образцов от человека пациентов был использован как для диагностики и научных целях. Большое количество животных модели были созданы для изучения корреляции между амилоида бремя и поведение, продолжительность жизни и ряда других фенотипические чтения выходы болезнь прогрессии2,3. Большие усилия предпринимаются также в лекарственных препаратах и дизайн в бой некоторых из наших наиболее опасается широко распространенных заболеваний. Однако оценка связи между генотипом, фенотип, амилоида налета нагрузки и медикаментов является не прямо вперед. Средства для окраски и обработки изображений из амилоида в ткани часто тупым и представить низким разрешением информацию о амилоида формирования и структуру.
Двойное лучепреломление Конго красный, ThT и тыс флуоресценции являются примеры классических методов для обнаружения и анализа амилоида бремя в образцах тканей от пациента биопсии и post mortem образцы и Животные модели болезни4. Эти методы были использованы на протяжении нескольких десятилетий (красный Конго с 1920 года и ThT и производных с 1960 года), и хотя инструментария был уточнен и позволяет для детального анализа, окрашивание процедуры анализа по-прежнему выполняются и так же, как почти полвека назад.
В настоящем документе мы описываем использование высокочувствительных Роман амилоида краситель, hFTAA5, что позволяет обнаружение малых незрелых белка месторождений с высокой точностью, а также обнаружения зрелых амилоид. По сравнению с обычными красками, hFTAA доказана обнаружить широкий спектр болезней связанных белков агрегаты5,6,7. Кроме того hFTAA также может применяться для оптического назначения различных агрегированных Морфотипы8. Здесь мы описываем, hFTAA окрашивание и анализ ткани от установленных животных моделей прионных болезни и амилоид β прекурсоров протеина (APP) трансгенных мышей предназначен для имитации развития зубного налета в болезнь Альцгеймера9,10 . Мы также показать анализ диагностических и post mortem образцов от пациентов, страдающих от системного амилоидоз. LCOs имеют внутренние свойства, которые позволяет им сообщить о конформационных различия в рамках одного налета; и путем объединения двух LCOs с различными свойствами относительно привязки и флуоресценции, разница становится еще более очевидной11. Помощью эпифлуоресцентного микроскопа оснащены фильтрами длинный пас и голова гиперспектральных камеры используется для включения объективной классификации спектральных свойств и записи микроскопии для спектрального анализа. Конфокальный флуоресцентной микроскопии с Перестраиваемый лазер в качестве источника возбуждения используется для оценки трехмерные свойства амилоидных бляшек в более подробно. Перестраиваемый лазер позволяет коллекции возбуждения спектра и шаг меньше выбор выбросов длин волн на микроскопе позволяет совместно изображений LCO флуоресценции и иммунофлюоресценции для определения совместного локализации целевого белка и амилоида. FLIM предлагает беспрецедентные чувствительность к конформационные различия навязаны LCOs и показывает различия, которые не могут быть обнаружены на спектры флуоресценции выбросов.
Основными целями с помощью описанных окрашивание метода являются для облегчения чувствительных обнаружения небольших амилоидоподобные залеми и характеризуют конформационного полиморфизма в пределах амилоидоподобные залеми. Это знание имеет важное значение для понимания основных заболеваний агрегации белков.
Protocol
Representative Results
Discussion
Осаждения белков, они сложить в амилоид является ключевым событием многих процессов болезни. Внеклеточные амилоидных бляшек состоит из значения пептидов и внутриклеточных нейрофибриллярных клубков, образованный hyperphosphorylated Тау находятся в головном мозге больных болезнью Альцгеймера. Спектр различных белков, например, Транстиретин (TTR), сыворотка амилоид A компонента (САА) и лёгкие цепи misfold IgG и манифест как амилоидоподобные залеми в тканях за пределами центральной нервной системы. Хотя амилоидных отложений были известны и изучал в течение более чем столетия, мы все еще не имеют детальное знание как амилоида осаждения инициируется на молекулярном уровне и что можно сделать, чтобы предотвратить этот процесс. Для болезни Альцгеймера это необходимо для подтверждения как процесс амилоидоз связан с нейродегенеративные. Один из ключевых квест на миссии для лечения амилоидоза является развивать Роман доработать инструменты для мониторинга амилоида посвящения, прогрессии и регрессии; Поэтому целевой амилоида обнаружения является ключевым. В долгосрочной перспективе клиническая диагностика выиграют от увеличения чувствительности и избирательности амилоида пятная методы7,15. Текущие проблемы в этом отношении огромные и очень активные исследования области. Прогностическая диагностика один главный вопрос для клинической разработки и испытания. Эти болезни могут начать задолго до появления симптомов, но начать с лечения там должно быть выявление заболевания. Здесь чувствительность является ключевым аспектом для новых методологий. Кроме того эта проблема является еще более сложным, потому что некоторые агрегаты белка являются токсичными, некоторые защитные и некоторые нейтральные. Поэтому способность контролировать конкретные агрегированных Морфотипы важно, поскольку существование различных агрегированных видов было предложено объяснить гетерогенных фенотип, сообщил для разнообразия нейродегенеративных заболеваний агрегации белков. К примеру прионных белков является классическим примером того, как можно misfold идентичные первичной последовательности аминокислот в собственный совокупных Морфотипы, которые порождают конкретные прионных штаммов. Поступили также аналогичные полиморфизм для значения пептид, α-synuclein и Тау. В этой связи LCOs показали выдающиеся инструментами для оптического назначения различных агрегированных Морфотипы. Агрегатов китовая птичка штамм определенного белка, белка месторождений в нескольких типов системных амилоидоза, а также полиморфные значения и Тау агрегатов отличились благодаря конформационно индуцированных оптическое явление наблюдается от LCOs.
Амилоидоподобные осаждения является событием, которое происходит в тканях, которые трудно проникнуть с биохимические и биофизические методы молекулярной точностью. Возможность зонда события ex vivo, в естественных условияхи в пробирке с использованием же молекулы LCO почву для разгадке события, которые происходят в естественных условиях с использованием методов, которые только можно применять на ex vivo или в in vitro образцы11,17. Структурная модель недавно сообщили высокой резолюции показывает, что LCO pentameric ЗСТСЮА (pFTAA) связывает в полости, образованные унифицированных боковых цепей параллельно оси волосики, охватывающих 6 в регистре параллельных бета стренги18, демонстрируя, что это можно получить атомной резолюции знаний о сущности LCO цели. В сущности режима привязки полости и привязки pFTAA похож на красный Конго19, продиктовано паз выстроились с повторяющиеся позитивные заряженных Lys боковой цепи. Сродство LCOs, как представляется, быть лучше по сравнению с Конго красный, вероятно, благодаря гибкости цепи и сильным ван-дер-Ваальса взаимодействия атомов серы Тиофен колец к полости гидрофобным. Обнаружение prefibrillar видов (до реагирует ThT)5,20 появляется зависит от повторяющихся β листы, состоящий из-регистр параллель бета нити, которые для hFTAA, будучи два Тиофен единиц больше, чем pFTAA бы диапазона пересечения до 8 бета пряди.
Окрашивание протокол требует внимания к неисправности на следующие шаги: (i) фиксации: обширные фиксации образцов тканей может нарушить структуру амилоида и ограничить возможность обнаружить различия в спектры флуоресценции, вызванных конформационные искажения молекулы hFTAA. Мягкой фиксации cryosections от свежемороженые материал предпочтителен для достижения оптимального спектрального разрешения. Однако hFTAA пятен и флуоресцировать амилоида в фиксированных тканей, но с ограниченной эффективности и менее спектральных вариации. (ii) Epitope экспозиции: Предварительная обработка для достижения epitope воздействия для антитела связывая иногда может уменьшить способность для hFTAA для привязки из ткани нарушается структура амилоида. Если это является проблемой, и epitope воздействия представляет собой решающий шаг в антитело пятная протокол, с помощью последовательных секций для антитела и hFTAA, соответственно может рассматриваться. (iii) overstaining: hFTAA является чрезвычайно чувствительным. Рабочие решения должны храниться при низкой Нм концентрации. Уменьшение концентрации hFTAA, если фон окраски является проблемой. Если элементы, которые связывают hFTAA разреженные в ткани, избыток hFTAA можно агрегировать и накапливаются в средне-и монтажа. Это признается в качестве флуоресценции, которая не находится в фокальной плоскости самой ткани. Если это, как представляется, погрузите слайд монтируется в PBS до тех пор, пока крышка выскальзования может быть скользнул секции, мыть с PBS и ремонта с свежими монтажа средних и новое покрытие скольжения. (iv) фильтр на основе изображений: этот документ описывает основном спектрально решена флуоресценции изображений с помощью фильтров длинный пас или несколько обнаружения каналов. hFTAA также может контролироваться с помощью фильтров короткий пас. Имейте в виду, что это будет уменьшить контраст и упразднить возможности для обнаружения нескольких цветов.
За последние годы стало очевидным, что как исследовательские инструменты, флуоресцентный LCOs, и в частности hFTAA Показать весьма перспективным свойства. Результаты продемонстрировали для разнообразных белков и болезненных состояний, начиная от обнаружения hFTAA агрегатов внутри клетки (Тау, включение тела миозит), системных амилоид сыворотки амилоид A, Транстиретин, легкие цепи иммуноглобулинов (Каппа и лямбда) seminogelin 1, прионных белков (включая клинические образцы)21, полипептид амилоида островка и инсулина7,15. Ограничивающим фактором для осуществления hFTAA как диагностический инструмент является что микроскопии флуоресцирования не широко используется в лабораториях рутинной амилоида патологии. Кроме того его не легко доступны в клинике. Однако hFTAA амилоида окрашивание и микроскопии флуоресцирования были использованы в клинических лабораториях в Микроскоп на основе флуоресценции фильтра и долженрассматриваться как бесплатный диагностический метод. Это недавно было продемонстрировано на запястья биопсии с Транстиретин амилоидоза, используя основные настройки для флуоресценции в автоматическом режиме22.
Кроме того помимо различных белков, hFTAA флуоресценции признает огромное разнообразие типов волосики и предварительно фибриллярного амилоида агрегатов, например, путь фибриллярного видов были обнаружены и характеризуется. В этом издании мы продемонстрировали один LCO на различных типах образца с помощью трех методов микроскопии. Использование контролируемых синтеза позволило также для развития LCOs для универсальный обнаружения биомолекулярных целей, например, записи взаимодействий поверхностного плазмон резонанс (СРП)23 и radiolabeling Позитрон выбросов томография (ПЭТ)24.
На сегодняшний день, были опубликованы более чем 25 различных LCOs с. Расширение использования LCOs для визуализации амилоидоподобные залеми увеличит знание и понимание как эти болезни связанные агрегатов собрать, разобрать и вмешиваться с органами и отдельными лицами, в которых они проживают.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить Mikael Линдгрен и Ханан Sluzny за консультацией по микроскопии флуоресцирования и Адриано Агусси, Йохан Bijzet, Бауке Hazenberg, Фрэнк Heppner, Матиас Jucker, Therese Klingstedt, Карин Магнуссон, Кристина Sigurdson, Даниэль Sjölander, Christoph Рёккен, Гунилла Westermark, за Westermark и Курт Затлоукал для содействия разделов ткани или микроскопии, отображаемые в этой публикации. Совокупность представленных данных здесь финансируется взносов от шведского мозга фонд (Hjärnfonden), Шведская Альцгеймера Ассоциация (Alzheimerfonden), Шведский исследовательский совет (VR), Ассоциация Йоран Густафссон, Георг & Astrid Olsson, здоровье 7РП ЕС проекта LUPAS и Университете Линчепинга.
Materials
| hFTAA/Amytracker545 | Ebba Biotech | ||
| Dako fluorescene mounting medium | Agilent technologies | GM304 | |
| LeicaDM6000 | Leica | ||
| Lumen 200 | Prior | ||
| Spectraview system | ASI spectral imaging | ||
| Spectraview software | ASI spectral imaging | ||
| LSM780 | Zeiss | ||
| Zen 2010b v6.0 software | Zeiss | ||
| FLIM system | Becker & Hickl | ||
| Ar/ML 458/488/514 | Zeiss | ||
| Tunable Laser In Tune | Zeiss |
References
- Sipe, J. D., et al. Amyloid fibril proteins and amyloidosis: chemical identification and clinical classification International Society of Amyloidosis 2016 Nomenclature Guidelines. Amyloid. 23, 209-213 (2016).
- Buxbaum, J. N. Animal models of human amyloidoses: are transgenic mice worth the time and trouble?. FEBS letters. 583, 2663-2673 (2009).
- Hall, A. M., Roberson, E. D. Mouse models of Alzheimer’s disease. Brain Res Bull. 88, 3-12 (2012).
- Westermark, G. T., Johnson, K. H., Westermark, P. Staining methods for identification of amyloid in tissue. Methods in enzymology. , 3-25 (1999).
- Klingstedt, T., et al. Synthesis of a library of oligothiophenes and their utilization as fluorescent ligands for spectral assignment of protein aggregates. Org Biomol Chem. 9, 8356-8370 (2011).
- Klingstedt, T., et al. Luminescent conjugated oligothiophenes for sensitive fluorescent assignment of protein inclusion bodies. Chembiochem. 14, 607-616 (2013).
- Sjolander, D., et al. Establishing the fluorescent amyloid ligand h-FTAA for studying human tissues with systemic and localized amyloid. Amyloid. 23, 98-108 (2016).
- Magnusson, K., et al. Multimodal fluorescence microscopy of prion strain specific PrP deposits stained by thiophene-based amyloid ligands. Prion. 8, 319-329 (2014).
- Radde, R., et al. Abeta42-driven cerebral amyloidosis in transgenic mice reveals early and robust pathology. EMBO Rep. 7, 940-946 (2006).
- Sturchler-Pierrat, C., et al. Two amyloid precursor protein transgenic mouse models with Alzheimer disease-like pathology. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 13287-13292 (1997).
- Nystrom, S., et al. Evidence for age-dependent in vivo conformational rearrangement within Abeta amyloid deposits. ACS chemical biology. 8, 1128-1133 (2013).
- Aslund, A., et al. Novel pentameric thiophene derivatives for in vitro and in vivo optical imaging of a plethora of protein aggregates in cerebral amyloidoses. ACS chemical biology. 4, 673-684 (2009).
- Nilsson, K. P., Herland, A., Hammarstrom, P., Inganas, O. Conjugated polyelectrolytes: conformation-sensitive optical probes for detection of amyloid fibril formation. Biochemistry. 44, 3718-3724 (2005).
- Mahajan, V., et al. Cross beta-sheet conformation of keratin 8 is a specific feature of Mallory-Denk bodies compared with other hepatocyte inclusions. Gastroenterology. 141, 1080-1090 (2011).
- Sjolander, D., Bijzet, J., Hazenberg, B. P., Nilsson, K. P., Hammarstrom, P. Sensitive and rapid assessment of amyloid by oligothiophene fluorescence in subcutaneous fat tissue. Amyloid. 22, 19-25 (2015).
- Arja, K., et al. Enhanced fluorescent assignment of protein aggregates by an oligothiophene-porphyrin-based amyloid ligand. Macromol Rapid Commun. 34, 723-730 (2013).
- Psonka-Antonczyk, K. M., et al. Nanoscale Structure and Spectroscopic Probing of Abeta1-40 Fibril Bundle Formation. Front Chem. 4, 44 (2016).
- Herrmann, U. S., et al. Structure-based drug design identifies polythiophenes as antiprion compounds. Sci Transl Med. 7, 299ra123 (2015).
- Schutz, A. K., et al. The amyloid-Congo red interface at atomic resolution. Angewandte Chemie (International ed). 50 (26), 5956-5960 (2011).
- Hammarstrom, P., et al. A fluorescent pentameric thiophene derivative detects in vitro-formed prefibrillar protein aggregates. Biochemistry. 49, 6838-6845 (2010).
- CORDIS. . Final Report Summary – LUPAS (Luminescent polymers for in vivo imaging of amyloid signatures). , (2013).
- Hahn, K., et al. Establishing and validating the fluorescent amyloid ligand h-FTAA (heptamer formyl thiophene acetic acid) to identify transthyretin amyloid deposits in carpal tunnel syndrome. Amyloid. , 1-9 (2017).
- Johansson, L. B., et al. An azide functionalized oligothiophene ligand–a versatile tool for multimodal detection of disease associated protein aggregates. Biosens Bioelectron. 63, 204-211 (2015).
- Nordeman, P., et al. (11)C and (18)F Radiolabeling of Tetra- and Pentathiophenes as PET-Ligands for Amyloid Protein Aggregates. ACS Med Chem Lett. 7, 368-373 (2016).
