Imaging amyloïde weefsels gekleurd met verlichte geconjugeerd Oligothiophenes door hyperspectrale Confocal Microscopie en fluorescentie levensduur Imaging
Summary
Amyloïde afzetting is een kenmerk van verschillende ziekten en treft vele verschillende organen. Deze paper beschrijft de toepassing van de fluorescentie van de verlichte geconjugeerd oligothiophene in combinatie met fluorescentie microscopie technieken kleuring. Deze kleuringstechniek vertegenwoordigt een krachtige tool voor de detectie en verkenning van eiwit-aggregaten in zowel klinische en wetenschappelijke opstellingen.
Abstract
Eiwitten die als amyloid in weefsels in het lichaam deponeren kunnen de oorzaak of het gevolg van een groot aantal ziekten. Daaronder vinden we neurodegeneratieve ziekten zoals Alzheimer en Parkinson’s ziekte treft voornamelijk het centraal zenuwstelsel en systemische amyloidose waar serum amyloid A, transthyretin en IgG lichte kettingen deponeren als amyloid in lever, carpaal tunnel, milt, nieren, hart en andere perifere weefsels. Amyloid is bekend en bestudeerd voor meer dan een eeuw, vaak met behulp van amyloïde specifieke kleurstoffen zoals Congo rood en Thioflavin T (ThT) of Thioflavin (ThS). In deze paper presenteren we het azijnzuur thiofeen van heptamer-formyl (hFTAA) als een voorbeeld van recent ontwikkelde aanvulling op deze kleurstoffen verlichte geconjugeerd oligothiophenes (LCOs) genoemd. hFTAA is makkelijk te gebruiken en is compatibel met mede kleuring in immunofluorescentie of met andere cellulaire markeringen. Uitgebreid onderzoek heeft bewezen dat hFTAA detecteert een breder scala van ziekte geassocieerde eiwit-aggregaten dan conventionele amyloïde kleurstoffen. Daarnaast kan de hFTAA ook worden toegepast voor optische toewijzing van verschillende geaggregeerde morphotypes dat studies van amyloïde fibril polymorfisme. Terwijl de imaging toegepaste methodologie is optioneel, wij hier tonen Hyperspectrale beeldvorming (ZIS), laser scanning confocal microscopie en fluorescentie levensduur imaging (FLIM). Deze voorbeelden tonen enkele van de beeldvormingstechnieken waar LCOs kunnen worden gebruikt als instrumenten voor meer gedetailleerde kennis van de vorming en structurele eigenschappen van amyloids. Een belangrijke beperking aan de techniek is, wat betreft alle conventionele optische microscopie technieken, de eis voor microscopische grootte van aggregaten om detectie. Bovendien moet het aggregaat een repetitieve β-sheet-structuur te voorzien in bindende hFTAA omvatten. Overmatige blootstelling voor fixatie en/of epitoop die wijzigen de structuur van de statistische of conformatie kan renderen van arme hFTAA bindende en vandaar vormen beperkingen aan nauwkeurige imaging.
Introduction
Afzetting van amyloid in weefsel is een pathologische kenmerk in een aantal ziekten zoals de ziekte van Alzheimer, ziekte van Parkinson, systemische amyloidose en prionziekten. Ondanks de prevalentie van amyloid-gerelateerde ziekten, en het feit dat bijna 40 verschillende eiwitten tot nu toe zijn aangemerkt als amyloïde precursoren in menselijke1, er is weinig bekend over de relatie tussen amyloïde afzetting en ziekte fenotype. Histologie van monsters van menselijke patiënten geweest zowel voor diagnostische en wetenschappelijke doeleinden gebruikt. Een groot aantal dierlijke modellen zijn vastgesteld om de onderzoeken van de correlatie tussen amyloïde last en gedrag, levensduur en een aantal andere fenotypische lezen outs van2,3van de progressie van de ziekte. Ook worden grote inspanningen ondernomen in drugontdekking en design aan de strijd van enkele van onze meest gevreesde wijdverbreide ziekten. De evaluatie van de verbinding tussen het genotype, fenotype, amyloïde plaque belasting en drug administration is echter niet recht vooruit. De hulpmiddelen voor vlekken en beeldvorming van amyloid in weefsel zijn vaak botte en lage resolutie informatie verschaffen over amyloïde formatie en structuur.
Congo rode dubbele breking, ThT en ThS fluorescentie zijn voorbeelden van klassieke methoden voor het opsporen en analyseren van amyloïde last in weefselmonsters van patiënt biopsieën en postmortem monsters en diermodellen voor ziekte4. Deze technieken zijn gebruikt voor decennia (Congo rood sinds de jaren 1920 en ThT en derivaten sinds de jaren 1960), en hoewel de instrumentatie werd verfijnd en voorziet in gedetailleerde analyse, de kleuring procedures en analyse worden nog steeds uitgevoerd op dezelfde wijze als bijna een eeuw geleden.
In dit artikel beschrijven we het gebruik van een hooggevoelige roman amyloïde kleurstof, hFTAA5, waarmee de opsporing van kleine onvolwassen eiwit deposito’s met een hoge nauwkeurigheid, evenals de detectie van volwassen amyloid. Vergeleken met conventionele kleurstoffen, is hFTAA bewezen om te ontdekken een breder scala van ziekte geassocieerde eiwit aggregaten5,6,7. Daarnaast kan de hFTAA ook worden toegepast voor optische toewijzing van verschillende geaggregeerde morphotypes8. Hierin beschrijven we hFTAA kleuring en analyse van weefsel van gevestigde diermodellen van prionziekte en Amyloid-β voorloper eiwit (APP) transgene muizen ontworpen na te bootsen plaque ontwikkeling in de ziekte van Alzheimer,9,10 . We tonen ook analyse van diagnostiek en postmortem monsters van patiënten met systemische amyloidose. De LCOs hebben intrinsieke eigenschappen waarmee ze verslag over conformationele verschillen binnen een plaque; en door het combineren van twee LCOs met verschillende eigenschappen met betrekking tot bindende en fluorescentie, het verschil is nog duidelijker11. Een Microscoop epifluorescence uitgerust met lange pass filters en een camerakop hyperspectrale wordt gebruikt om objectieve classificatie van spectrale eigenschappen en opname van microfoto voor spectrale analyse. Confocale fluorescentie microscopie met een afstembare laser als bron excitatie wordt gebruikt ter beoordeling van de drie-dimensionale eigenschappen van een amyloïde plaque in meer detail. De afstembare laser kunt collectie van excitatie spectrum en een stap minder selectie van emissie golflengten op de Microscoop kunt co beeldvorming van LCO fluorescentie en immunofluorescentie bepalen mede lokalisatie van doel eiwit en amyloid. FLIM biedt ongekende gevoeligheid voor conformationele verschillen de LCOs opgelegd en verschillen die niet kunnen worden gedetecteerd op de fluorescentie emissie spectra onthult.
De belangrijkste doelstellingen met de beschreven kleuringstechniek zijn te vergemakkelijken van gevoelige detectie van amyloïde stortingen en te karakteriseren conformationele polymorfisme binnen amyloïde deposito’s. Deze kennis is belangrijk voor de basiskennis van eiwit aggregatie ziekten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Afzetting van aberrantly gevouwen eiwitten in amyloid is een belangrijke gebeurtenis van vele ziekteprocessen. Extracellulaire amyloïde plaques samengesteld uit Aβ peptiden en intracellulaire neurofibrillary klitten gevormd door hyperphosphorylated tau zijn te vinden in de hersenen van Alzheimer-patiënten. Een assortiment van verschillende eiwitten, bijvoorbeeld, transthyretin (TTR), Serum Amyloid A component (SAO), en IgG lichtketting misfold en manifest als amyloïde deposito’s in weefsels buiten de CNS. Hoewel amyloid deposito’s zijn bekend en studeerde voor meer dan een eeuw, we nog steeds niet over gedetailleerde kennis van hoe amyloïde wordt afzetting gestart op moleculair niveau en wat kan worden gedaan om te voorkomen dat dit proces. Voor Alzheimer’s disease is het noodzakelijk om te bevestigen hoe het proces van amyloidose neurodegeneratie gekoppeld is. Één belangrijke zoektocht op de missie voor de behandeling van amyloidose is verfijnd om roman tools voor de monitoring van amyloïde initiatie, progressie en regressie; Vandaar is gerichte amyloïde detectie de sleutel. Op de lange termijn, zullen klinische diagnostiek profiteren van het verhogen van de gevoeligheid en selectiviteit van amyloïde kleuring methoden7,15. Huidige uitdagingen in dit opzicht zijn enorm en is een zeer actief onderzoeksgebied. Een hoofdthema voor klinische ontwikkeling en proeven is prognostische diagnose. Deze ziekten waarschijnlijk starten goed voordat de symptomen verschijnen, maar om te beginnen met de behandeling er moet identificatie van de ziekte. Gevoeligheid is hierin een belangrijk aspect voor nieuwe methoden. Bovendien, deze kwestie is nog complexer omdat sommige eiwit-aggregaten giftig zijn, sommige beschermende zijn, en sommige neutraal zijn. Vandaar is de mogelijkheid om te controleren op specifieke geaggregeerde morphotypes essentieel aangezien het bestaan van verschillende geaggregeerde soorten om uit te leggen het heterogene fenotype gemeld voor een verscheidenheid van neurodegeneratieve eiwit aggregatie ziekten heeft gesuggereerd. Bijvoorbeeld, is het prion-eiwit een klassiek voorbeeld van hoe een identieke primaire opeenvolging van aminozuren kan voorkomen in verschillende statistische morphotypes, die aanleiding tot specifieke prion stammen geven. Soortgelijke polymorfisme is ook gemeld voor Aβ peptide, α-synuclein, en tau. In dit verband LCOs gebleken te zijn uitstekende tools voor optische toewijzing van verschillende geaggregeerde morphotypes. Prion-stam-specifieke eiwit-aggregaten, eiwit deposito’s gevonden in verschillende soorten systemische amyloidose, evenals polymorfe Aβ en tau aggregaten hebben is onderscheiden als gevolg van de conformationally geïnduceerde optisch fenomeen waargenomen vanaf de LCOs.
Amyloïde afzetting is een evenement dat in de weefsels die moeilijk plaatsvindt te penetreren met biochemische of biofysische methodes van moleculaire precisie. De mogelijkheid om te sonderen gebeurtenissen ex vivo, in vivoen in vitro met behulp van de dezelfde LCO moleculen stelt het podium ontrafeling gebeurtenissen die zich in vivo met technieken die alleen mogelijk toe te passen op ex vivo of voordoen zijn in vitro monsters11,17. Een onlangs gerapporteerde hoge resolutie structurele model toont aan dat de pentameric LCO ALCA (pFTAA) in een holte gevormd door uitgelijnde zijketens parallel met de as van de fibril verspreid over 6 in-register bèta-samengebonden18 bindt, waaruit blijkt dat het mogelijke atomaire resolutie kennis over de entiteiten van het LCO doel te krijgen. De bindende Holte en bindende wijze van pFTAA is in wezen vergelijkbaar met Congo rood19, ingegeven door een groef bekleed met repetitieve positief geladen Lys-zijketens. De affiniteit van LCOs lijken te worden beter in vergelijking met Congo red waarschijnlijk te wijten aan de flexibiliteit van de keten en sterke van der Waals interacties van de zwavel atomen van de thiofeen ringen naar de hydrofobe holte. De opsporing van prefibrillar soorten (vóór ThT reageert)5,20 verschijnt afhankelijk van repetitieve β bladen, samengesteld uit parallel-bèta-strengen van de in-registreren, die voor hFTAA worden twee thiofeen eenheden langer dan pFTAA zou overschrijding van de maximaal 8 bèta-strengen beslaan.
De kleuring protocol vereist aandacht te besteden aan opsporen van storingen bij de volgende stappen uit: (i) fixatie: uitgebreide fixatie van weefselmonsters kan verstoren de amyloïde structuur en beperken de mogelijkheid om te detecteren variatie in fluorescentie spectra geïnduceerd door conformationele vervorming van het hFTAA molecuul. Milde fixatie van cryosecties van vers bevroren materiaal heeft de voorkeur om optimale spectrale resolutie. Echter zal de hFTAA vlek en lichten amyloid in vaste weefsel maar met verminderde werkzaamheid en minder spectrale variatie. (ii) epitoop blootstelling: voorbehandeling van weefsel tot epitoop blootstelling voor antilichaam-bindende af en toe de mogelijkheid voor hFTAA om te binden beperken misschien omdat verstoord amyloïde structuur. Als dit een probleem is en epitoop blootstelling een cruciale stap in het antilichaam kleuring protocol is, met behulp van opeenvolgende secties voor antilichaam en hFTAA, kunnen respectievelijk worden beschouwd. (iii) overstaining: hFTAA is uiterst gevoelig. Werkoplossing dient te worden bewaard bij lage nM concentratie. Vermindert de concentratie van hFTAA indien achtergrondkleuring een probleem is. Als elementen die hFTAA binden schaars in het weefsel zijn, kan een overmaat van hFTAA statistische en zich ophopen in het medium van de montage. Dit wordt erkend als de fluorescentie die niet in het vlak van de focus van het weefsel zelf. Als dit wordt weergegeven, dompel u de gekoppelde dia in PBS totdat u de slip van de cover van de sectie kan worden geschoven, wassen met PBS en remount met verse montage medium en een nieuwe cover slip. (iv) filter gebaseerd beeldvorming: dit Witboek beschrijft meestal spectraal opgelost fluorescentie geschikt zijn met behulp van lange pass filters of meerdere detectie kanalen. hFTAA kunnen ook worden gecontroleerd met behulp van korte pass filters. Wees u ervan bewust dat dit zal het contrast verminderen en afschaffing van de mogelijkheden voor het detecteren van meerdere kleuren.
De laatste jaren is het geworden duidelijk dat als onderzoekinstrumenten te, TL LCOs en in het bijzonder hFTAA zeer veelbelovende eigenschappen weergeven. Resultaten voor een grote verscheidenheid van eiwitten en ziekte staten, variërend van hFTAA detectie van aggregaten binnen cellen (tau, integratie lichaam myositis), systemische amyloid van serum amyloid A, transthyretin, Immunoglobulin lichte kettingen hebben aangetoond (kappa en Lambda) seminogelin 1, prion-eiwit (met inbegrip van klinische monsters)21Islet amyloïde polypeptide en insuline7,15. Een beperkende factor voor de uitvoering van hFTAA als een diagnostisch hulpprogramma is dat fluorescentie microscopie wordt niet uitgebreid gebruikt in routine amyloïde pathologie labs. Bovendien is zijn niet beschikbaar in de kliniek. Echter hFTAA amyloïde kleuring en fluorescentie microscopie in klinische laboratoria in een filter op basis van de fluorescentie Microscoop zijn gebruikt en moetenworden beschouwd als een gratis diagnostische methode. Dit werd onlangs aangetoond op carpaal tunnel biopsieën met transthyretin amyloidose met behulp van de basisinstellingen voor fluorescentie in een geautomatiseerde wijze22.
Verder naast verschillende eiwitten, hFTAA fluorescentie herkent een grote verscheidenheid van fibril soorten en vooraf fibrillar amyloïde aggregaten, bijvoorbeeld, traject fibrillar soorten hebben gevonden en gekenmerkt. In deze publicatie laten we één LCO op verschillende typen van de monster met behulp van drie microscopie technieken. Het gebruik van gecontroleerde synthese heeft ook toegestaan voor de ontwikkeling van LCOs voor veelzijdige detectie van biomoleculaire doelstellingen, bijvoorbeeldregistratie van de interacties door oppervlakte plasmon resonantie (SPR)23 en radiolabeling voor positron-emissie tomografie (PET)24.
Tot op heden zijn meer dan 25 verschillende LCOs met gepubliceerd. Een intensiever gebruik van LCOs voor beeldvorming van amyloïde deposito’s vergroot de kennis en begrip van hoe deze ziekte-geassocieerde aggregaten monteren, demonteren en interfereren met de organen en de personen waar zij wonen.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedank Mikael Lindgren en Chanan Sluzny voor advies over fluorescentie microscopie, en Adriano Aguzzi, Johan Bijzet, Bouke Hazenberg, Frank Heppner, Mathias Jucker, Therese Klingstedt, Karin Magnusson, Christina Sigurdson, Daniel Sjölander, Christoph Röcken, Gunilla Westermark, Per Westermark en Kurt Zatloukal om bij te dragen weefselsecties of microfoto weergegeven in deze publicatie. Het verzamelen van gepresenteerde gegevens hierin is gefinancierd door bijdragen van Zweedse hersenen Foundation (Hjärnfonden), de Zweedse Alzheimer association (Alzheimerfonden), de Zweedse Onderzoeksraad (VR), de vereniging van Göran Gustafsson, Georg & Astrid Olsson, EU KP7 Gezondheidsproject LUPAS en de Universiteit van Linköping.
Materials
| hFTAA/Amytracker545 | Ebba Biotech | ||
| Dako fluorescene mounting medium | Agilent technologies | GM304 | |
| LeicaDM6000 | Leica | ||
| Lumen 200 | Prior | ||
| Spectraview system | ASI spectral imaging | ||
| Spectraview software | ASI spectral imaging | ||
| LSM780 | Zeiss | ||
| Zen 2010b v6.0 software | Zeiss | ||
| FLIM system | Becker & Hickl | ||
| Ar/ML 458/488/514 | Zeiss | ||
| Tunable Laser In Tune | Zeiss |
References
- Sipe, J. D., et al. Amyloid fibril proteins and amyloidosis: chemical identification and clinical classification International Society of Amyloidosis 2016 Nomenclature Guidelines. Amyloid. 23, 209-213 (2016).
- Buxbaum, J. N. Animal models of human amyloidoses: are transgenic mice worth the time and trouble?. FEBS letters. 583, 2663-2673 (2009).
- Hall, A. M., Roberson, E. D. Mouse models of Alzheimer’s disease. Brain Res Bull. 88, 3-12 (2012).
- Westermark, G. T., Johnson, K. H., Westermark, P. Staining methods for identification of amyloid in tissue. Methods in enzymology. , 3-25 (1999).
- Klingstedt, T., et al. Synthesis of a library of oligothiophenes and their utilization as fluorescent ligands for spectral assignment of protein aggregates. Org Biomol Chem. 9, 8356-8370 (2011).
- Klingstedt, T., et al. Luminescent conjugated oligothiophenes for sensitive fluorescent assignment of protein inclusion bodies. Chembiochem. 14, 607-616 (2013).
- Sjolander, D., et al. Establishing the fluorescent amyloid ligand h-FTAA for studying human tissues with systemic and localized amyloid. Amyloid. 23, 98-108 (2016).
- Magnusson, K., et al. Multimodal fluorescence microscopy of prion strain specific PrP deposits stained by thiophene-based amyloid ligands. Prion. 8, 319-329 (2014).
- Radde, R., et al. Abeta42-driven cerebral amyloidosis in transgenic mice reveals early and robust pathology. EMBO Rep. 7, 940-946 (2006).
- Sturchler-Pierrat, C., et al. Two amyloid precursor protein transgenic mouse models with Alzheimer disease-like pathology. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 13287-13292 (1997).
- Nystrom, S., et al. Evidence for age-dependent in vivo conformational rearrangement within Abeta amyloid deposits. ACS chemical biology. 8, 1128-1133 (2013).
- Aslund, A., et al. Novel pentameric thiophene derivatives for in vitro and in vivo optical imaging of a plethora of protein aggregates in cerebral amyloidoses. ACS chemical biology. 4, 673-684 (2009).
- Nilsson, K. P., Herland, A., Hammarstrom, P., Inganas, O. Conjugated polyelectrolytes: conformation-sensitive optical probes for detection of amyloid fibril formation. Biochemistry. 44, 3718-3724 (2005).
- Mahajan, V., et al. Cross beta-sheet conformation of keratin 8 is a specific feature of Mallory-Denk bodies compared with other hepatocyte inclusions. Gastroenterology. 141, 1080-1090 (2011).
- Sjolander, D., Bijzet, J., Hazenberg, B. P., Nilsson, K. P., Hammarstrom, P. Sensitive and rapid assessment of amyloid by oligothiophene fluorescence in subcutaneous fat tissue. Amyloid. 22, 19-25 (2015).
- Arja, K., et al. Enhanced fluorescent assignment of protein aggregates by an oligothiophene-porphyrin-based amyloid ligand. Macromol Rapid Commun. 34, 723-730 (2013).
- Psonka-Antonczyk, K. M., et al. Nanoscale Structure and Spectroscopic Probing of Abeta1-40 Fibril Bundle Formation. Front Chem. 4, 44 (2016).
- Herrmann, U. S., et al. Structure-based drug design identifies polythiophenes as antiprion compounds. Sci Transl Med. 7, 299ra123 (2015).
- Schutz, A. K., et al. The amyloid-Congo red interface at atomic resolution. Angewandte Chemie (International ed). 50 (26), 5956-5960 (2011).
- Hammarstrom, P., et al. A fluorescent pentameric thiophene derivative detects in vitro-formed prefibrillar protein aggregates. Biochemistry. 49, 6838-6845 (2010).
- CORDIS. . Final Report Summary – LUPAS (Luminescent polymers for in vivo imaging of amyloid signatures). , (2013).
- Hahn, K., et al. Establishing and validating the fluorescent amyloid ligand h-FTAA (heptamer formyl thiophene acetic acid) to identify transthyretin amyloid deposits in carpal tunnel syndrome. Amyloid. , 1-9 (2017).
- Johansson, L. B., et al. An azide functionalized oligothiophene ligand–a versatile tool for multimodal detection of disease associated protein aggregates. Biosens Bioelectron. 63, 204-211 (2015).
- Nordeman, P., et al. (11)C and (18)F Radiolabeling of Tetra- and Pentathiophenes as PET-Ligands for Amyloid Protein Aggregates. ACS Med Chem Lett. 7, 368-373 (2016).
