Este manuscrito descreve como distinguir diferentes nemátodes usando assinaturas de difração consideravelmente-campo. Comparamos a locomoção de 139 tipo selvagem e 108 “rolo” c. elegans por uma média de frequências associadas a assinatura de difração de Fraunhofer temporal em um único local usando um laser de onda contínua.
Este manuscrito descreve como classificar nemátodes usando assinaturas de difração de longe-campo temporal. Um único c. elegans é suspenso em uma coluna de água dentro de uma cubeta do óptica. 632 nm onda contínua aqui vai laser é dirigido através da cubeta usando espelhos de superfície frontais. Uma distância significativa de pelo menos 20-30 cm viajado depois a luz passa através da cubeta garante um padrão de difração (Fraunhofer) consideravelmente-campo útil. As mudanças do padrão de difração em tempo real como o nematódeo nada dentro do feixe de laser. O fotodiodo é colocado fora do centro no padrão de difração. O sinal de tensão proveniente do fotodiodo é observado em tempo real e gravado usando um osciloscópio digital. Este processo é repetido para 139 tipo selvagem e 108 “rolo” c. elegans. Vermes do tipo selvagem exibem um padrão de oscilação rápida na solução. Os vermes “rolo” tem uma mutação em um componente-chave da cutícula que interfere com locomoção macia. Intervalos de tempo que não estão livres de saturação e a inatividade são descartados. É prático dividir cada média por seu máximo para comparar intensidades relativas. O sinal para cada worm é a transformada de Fourier para que o padrão de frequência para cada verme emerge. O sinal para cada tipo de verme é média. Os espectros de Fourier em média para o tipo selvagem e o “rolo” de c. elegans são distintamente diferentes e revelam que as formas de worm dinâmico das duas estirpes worm diferentes podem ser distinguidas usando análise de Fourier. O espectro de Fourier de cada estirpe worm coincidir com um modelo aproximado usando duas formas diferentes de worm binário que correspondem a momentos locomotora. O envelope com a distribuição de frequência em média para vermes reais e modelados confirma o modelo coincide com os dados. Este método pode servir como base para a análise de Fourier para muitas espécies microscópicas, como cada microorganismo terá seu único espectro de Fourier.
Este método compara espectros de frequência experimental e modelada a locomoção de c. elegans usando duas linhagens com diferentes padrões locomotora. Os resultados mostram que o espectro de frequência depende de mudanças temporais como o nematódeo nada em uma coluna de água, para que imagens microscópicas clara não são necessários para a análise. Este método permite a análise em tempo real quantitativa e fornece informações complementares para imagens e vídeos obtidos com microscópios tradicionais. Difração de Fraunhofer, também chamada de difração consideravelmente-campo, fornece a base para a obtenção de dados de difração ao vivo1,2. A intensidade da luz em qualquer ponto no padrão de difração é o resultado da sobreposição de luz de cada ponto do contorno do nematoide3. Como resultado, a intensidade da luz coletada ao longo do tempo carrega informações sobre a locomoção do nemátodo. Analisar o sinal de difração de tempo-dependente pode identificar o movimento característico do mutante correspondente desde analisar todas as frequências envolvidas na locomoção complementa a tradicional análise de vídeo. Neste caso, confirmam-se as diferenças características entre a locomoção do “rolo” e selvagem tipo c. elegans , comparando os espectros de frequência das duas estirpes diferentes do nemátodo do pinheiro.
Algumas características anteriores foram confirmadas através da análise de frequência de sinais de difração, como natação frequências2,4. Mais importante ainda, este método pode ser usado como um método complementar para microscopia tradicional para observar a locomoção em tempo real na tela do computador, como os dados estão sendo coletados. O espectro de frequência de vermes com padrões distintos de locomotor pode ser quantificado por considerar que o Fourier transforma sinal do sinal de difração.
A natureza multidisciplinar da difração de Fourier-baseado neste trabalho envolve os campos da biologia e da física. Difração por sob amostragem tem sido muito utilizada para investigar estruturas de cristal em biologia5 e outros campos. Neste experimento, no entanto, oversampling6,7 cria o padrão de difração consideravelmente-campo para que o organismo está centralizado no feixe de laser. Sobreamostragem é normalmente usada para lente menos imagem8 em conjunto com um algoritmo de recuperação de fase que reconstrói uma imagem do objeto original. Fase de recuperação é difícil de alcançar quando para disseminar está presentes, como é o caso com um nematódeo. A assinatura de difração temporal é suficiente para avaliar frequências chaves do movimento de verme. Esse método é menos desgastante computacionalmente e fornece um caminho óptico para quantificar a locomoção. Esta técnica pode ser facilmente adaptada para a análise de mutações ou condições ambientais que alteram o comportamento.
Incluindo os trechos de dados com a inatividade distorcerá os resultados desde frequências mais baixas de artificiais vão ser em média em resultados. Saturar o fotodiodo pode ser reconhecido por picos planos ou picos de “cortar” os dados em bruto. Dividindo cada conjunto de dados bruto por intensidades de pico vai ajudar com a contabilidade para as flutuações na intensidade do laser.
As frequências de pico são um indicador da global se debatendo a frequência; no entanto, o movimento complicado causa interferência em frequências beat no padrão de difração e precisa ser examinado cuidadosamente.
Esse método pode ser usado para investigar a locomoção de outros nematoides. O ambiente pode ser alterado para outro meio. Comprimentos de onda podem ser alterados também. Trabalhando na faixa visível do espectro eletromagnético é mais fácil e mais seguro.
Um modelo mais refinado simulará os espectros de difração mais realisticamente no futuro. Um futuro modelo pode incluir um worm que pode alterar as orientações, que não afetaria a frequência locais mas alturas ou relativo. Um modelo mais realista permitiria uma distribuição probabilística de frequências de goleada, que iria ampliar os picos como os dados experimentais. Uma propagação em frequências explicaria as variações nas frequências de goleada.
A forma atual do worm é bruta, especialmente na região da cabeça e cauda, que deve ser mais cônico do que no modelo atual. Pode ser interessante realizar uma análise detalhada da série hora do sinal desde que pode dar pistas sobre a complexidade da locomoção em diferentes mutantes.
Vale a pena considerar a praticidade de expandir essa técnica para caracterizar vários nematoides simultaneamente. Este método deve ser entendido como um método complementar aos métodos existentes usando microscópios tradicionais. Este método tem a vantagem de não exigir um microscópio durante a aquisição de dados para que o worm pode mover-se fora do plano focal. Os espectros de frequência média mostram claras diferenças no movimento do verme e podem ser quantificados pelos picos de frequência predominante, que é um método novo para quantificar a locomoção da minhoca. Análise de dados de assinaturas de difração está em desenvolvimento e espero que conduzirá a um processo de identificação automatizada de vários mutantes e indivíduos.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos suas contribuições computacionais com este projeto Juan Vasquez. Agradecemos o apoio do Vassar College graduação pesquisa Summer Institute (URSI), o fundo de investigação do salmão de Maynard Lucy e NSF prêmio n º 1058385.
Tunable Helium-Neon laser | Research Electro-Optics | 30602 | Four wavelengths can be selected between 543 nm and 633 nm. |
2 Front Surface Aluminum Mirrors | Thorlabs | PF10-03-F01 | |
Photodiode: SI Amplified Detector | Thorlabs | PDA 100A | |
Quartz Cuvette | Starna Cells | 21/G/5 | Plastic cells may be used as well. |
MatLab (Software) | MathWorks | R2016b (9.1.0.441655) | Use the fft command to simulate diffraction |
Excel | Microsoft | 14.7.1 | Used for data analysis of Fig. 4 |
Caenorhabditis elegans Roller | University of Minnesota Caenorhabditis elegans Center (CGC) | Strain: OH7547 Genotype: otIs199. |
https://cbs.umn.edu/cgc/home |
Caenorhabditis elegans Wild Type | University of Minnesota Caenorhabditis elegans Center (CGC) | Strain:N2 Genotype: C. elegans wild isolate | https://cbs.umn.edu/cgc/home |