Fourier-basierte Beugung Live-Analyse von Caenorhabditis elegans
Summary
Dieses Manuskript wird beschrieben, wie verschiedene Nematoden Fernfeld Beugung Signaturen zu unterscheiden. Wir vergleichen die Fortbewegung von 139 Wildtyp und 108 “Roller” C. Elegans durch Mittelung Frequenzen die zeitliche Fraunhofer Beugung Signatur an einem Standort mit Hilfe eines Lasers kontinuierliche Welle zugeordnet.
Abstract
Dieses Manuskript beschreibt die Nematoden mit zeitlichen Fernfeld Beugung Signaturen zu klassifizieren. Ein einzelnes C. Elegans ruht in einer Wassersäule in einer optischen Küvette. Ein 632 nm kontinuierliche Welle HeNe-Laser wird durch die Küvette unter Verwendung der vorderen Oberfläche Spiegel gerichtet. Ein deutlichen Abstand von mindestens 20-30 cm reiste nach das Licht die Küvette durchläuft gewährleistet eine nützliche Fernfeld (Fraunhofer) Beugungsmuster. Die Beugung Muster Änderungen in Echtzeit wie die Nematoden schwimmt in den Laserstrahl. Die Fotodiode wird in das Beugungsmuster außermittig platziert. Das Spannungssignal von der Photodiode wird in Echtzeit beobachtet und über ein digitales Oszilloskop aufgezeichnet. Dieser Vorgang ist für 139 Wildtyp und 108 “Roller” C. Eleganswiederholt. Wildtyp-Würmer zeigen eine schnelle Schwingungsmuster in Lösung. Die “Roller” Würmer haben eine Mutation in eine Schlüsselkomponente der Nagelhaut, die mit glatten Fortbewegung behindert. Zeitintervalle, die nicht frei von Sättigung und Inaktivität werden verworfen. Es ist praktisch jeder Schnitt durch seine maximale relative Intensität zu vergleichen zu teilen. Das Signal für jeden Wurm ist, dass Fourier transformiert, damit ergibt sich die Frequenzmuster für jeden Wurm. Das Signal für jede Art von Wurm wird gemittelt. Die gemittelten Fourier-Spektren für die wilde Art und der “Roller” C. Elegans unterscheiden sich deutlich und zeigen, dass die dynamische Wurm Formen der beiden anderen Wurm Stämme mit Hilfe der Fourier-Analyse unterschieden werden können. Die Fourier-Spektren von jedem Wurm Stamm passen eine ungefähre Modell mit zwei verschiedenen binären Wurm-Formen, die Muskeln Momente entsprechen. Der Umschlag der gemittelten Häufigkeitsverteilung für tatsächliche und modellierten Würmer bestätigt, dass das Modell die Daten übereinstimmt. Diese Methode dient als Grundlage für die Fourier-Analyse für viele mikroskopisch kleine Arten, wie jeder Mikroorganismus seine einzigartige Fourier-Spektrum haben.
Introduction
Diese Methode vergleicht experimentelle und modellierten Frequenzspektren der Fortbewegung von C. Elegans mit zwei Sorten mit sehr unterschiedlichen lokomotorischen Muster. Die Ergebnisse zeigen, dass das Frequenzspektrum von zeitlichen Veränderungen abhängt, da die Nematoden in einer Wassersäule schwimmt, so dass klare mikroskopische Bilder nicht für die Analyse benötigt werden. Diese Methode ermöglicht die quantitative Echtzeit-Analyse und bietet ergänzende Informationen, Bilder und Videos mit traditionellen Mikroskope erhalten. Fraunhofer Beugung, auch genannt Fernfeld Beugung, bildet die Grundlage für den Erhalt der live Beugung Daten1,2. Die Lichtintensität an jedem einzelnen Punkt in das Beugungsmuster ist das Ergebnis der Überlagerung von Licht aus allen Richtungen in der Gliederung der Nematoden3. Infolgedessen trägt die Lichtintensität im Laufe der Zeit gesammelt Informationen über die Fortbewegung der Nematoden. Analyse der zeitabhängigen Beugung-Signal kann die charakteristische Bewegung der entsprechenden Mutante identifizieren, da analysieren alle Beteiligten in der Fortbewegung Frequenzen die traditionellen video-Analyse ergänzt. In diesem Fall werden die charakteristischen Unterschiede zwischen der Fortbewegung der “Walze” und Wildtyp C. Elegans bestätigt durch den Vergleich der Frequenz-Spektren von zwei verschiedenen Stämmen von Nematoden.
Einige frühere Merkmale wurden mit Frequenzanalyse der Beugung Signale wie Schwimmbad Frequenzen2,4bestätigt. Noch wichtiger ist, kann diese Methode verwendet werden als ergänzende Methode zur traditionellen Mikroskopie, um Fortbewegung in Echtzeit auf einem Computerbildschirm zu beobachten, wie die Daten erhoben werden. Das Frequenzspektrum der Würmer mit unterschiedlichen lokomotorischen Muster kann quantifiziert werden, unter Berücksichtigung, dass die Fourier Signal von der Beugung Signal umgewandelt.
Des interdisziplinären Charakters der Fourier-basierte Beugung in dieser Arbeit umfasst die Bereiche der Biologie und Physik. Beugung durch unter Probenahme wurde lange zur Kristallstrukturen in Biologie5 und anderen Bereichen zu untersuchen. In diesem Experiment schafft jedoch oversampling6,7 der Fernfeld Beugungsmuster so dass der Organismus in den Laserstrahl zentriert ist. Oversampling ist in der Regel für Objektiv-weniger bildgebende8 in Verbindung mit einer Phase Retrieval-Algorithmus verwendet, die ein Bild des ursprünglichen Objekts rekonstruiert. Phase Retrieval ist schwer zu erreichen wenn Streusignal vorhanden sind, wie der Fall mit einem Fadenwurm ist. Die zeitliche Beugung Unterschrift genügt, um Schlüsselfrequenzen der Wurm Bewegung zu bewerten. Diese Methode ist weniger rechnerisch Besteuerung und bietet eine optische Möglichkeit zur Fortbewegung zu quantifizieren. Diese Technik könnte ohne weiteres zur Analyse von Mutationen oder Umgebungsbedingungen, die Verhalten ändern angepasst werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Darunter erstreckt sich von Daten mit Inaktivität wird die Ergebnisse verzerren, da künstliche niedrigere Frequenzen in die Ergebnisse gemittelt werden. Die Photodiode Sättigung erkennt man an flachen Spitzen oder “abgeschnitten” Gipfeln in den Rohdaten. Teilung jeder Rohdatensatz durch Peak Intensitäten helfen bei Bilanzierung von Schwankungen in der Laserintensität.
Die Peak-Frequenzen sind ein Indikator für die allgemeine Prügel Frequenz; Allerdings komplizierte Bewegung verursacht Störungen bei beat Frequenzen in das Beugungsmuster und müssen sorgfältig geprüft werden.
Diese Methode kann verwendet werden, um die Fortbewegung der anderen Nematoden zu untersuchen. Die Umwelt kann auf ein anderes Medium geändert werden. Wellenlängen können auch geändert werden. Arbeiten im sichtbaren Bereich des elektromagnetischen Spektrums ist die einfachste und sicherste.
Eine verfeinerte Modell simuliert die Beugung Spektren realistischer in die Zukunft. Ein Zukunftsmodell gehören einen Wurm, der Orientierungen, ändern die Frequenz Standorte aber relative Gipfel Höhen nicht beeinträchtigen würde. Ein realistischeres Modell würde eine probabilistische Verteilung der Prügel Frequenzen ermöglichen die die Gipfeln wie in den experimentellen Daten erweitern würde. Eine Ausbreitung in Frequenzen würden Variationen in Tracht Prügel Frequenzen ausmachen.
Die aktuelle Wurm-Form ist grob, vor allem in den Kopf und Schweif Region, die mehr als im aktuellen Modell verjüngt werden sollte. Es kann interessant sein, eine detaillierte Analyse der Zeitreihen des Signals zu führen, da es Hinweise auf die Komplexität der Fortbewegung in verschiedenen Mutanten geben könnte.
Es lohnt sich, die Praktikabilität der Erweiterung dieser Technik in mehreren Nematoden gleichzeitig Charakterisierung. Diese Methode sollte als ergänzende Methode zur bestehenden Methoden mit traditionellen Mikroskope verstanden werden. Diese Methode hat einen Vorteil in ein Mikroskop nicht während der Datenerfassung erfordern, so dass der Wurm aus der Brennebene bewegen kann. Die gemittelten Frequenz-Spektren zeigen deutliche Unterschiede in der Wurm Bewegung und von den vorherrschenden Frequenz Gipfeln quantifiziert werden können ist eine neuartige Methode bei der Quantifizierung Wurm Fortbewegung. Datenanalyse der Beugung Signaturen ist bei der Weiterentwicklung und wird hoffentlich zu einer automatisierten Identifikationsprozess mehrere Mutanten und Einzelpersonen führen.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Juan Vasquez für seine rechnerische Beiträge mit diesem Projekt. Wir sind dankbar für die Unterstützung der Vassar College Undergraduate Research Summer Institute (URSI), Lucy Maynard Lachs Research Fund und der NSF Award Nr. 1058385.
Materials
| Tunable Helium-Neon laser | Research Electro-Optics | 30602 | Four wavelengths can be selected between 543 nm and 633 nm. |
| 2 Front Surface Aluminum Mirrors | Thorlabs | PF10-03-F01 | |
| Photodiode: SI Amplified Detector | Thorlabs | PDA 100A | |
| Quartz Cuvette | Starna Cells | 21/G/5 | Plastic cells may be used as well. |
| MatLab (Software) | MathWorks | R2016b (9.1.0.441655) | Use the fft command to simulate diffraction |
| Excel | Microsoft | 14.7.1 | Used for data analysis of Fig. 4 |
| Caenorhabditis elegans Roller | University of Minnesota Caenorhabditis elegans Center (CGC) | Strain: OH7547 Genotype: otIs199. |
https://cbs.umn.edu/cgc/home |
| Caenorhabditis elegans Wild Type | University of Minnesota Caenorhabditis elegans Center (CGC) | Strain:N2 Genotype: C. elegans wild isolate | https://cbs.umn.edu/cgc/home |
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