フーリエ ベース回折分析のライブの線虫

1 です。 c. の elegans の成長とメインテナンス 準備線虫の培養皿。 ペトリ皿の寒天液を詰めて、にして、OP50 の エシェリヒア属大腸菌 の培養と種子ひずみ 9 , 10 を固め、おきます。 大腸菌 パッチと新鮮な寒天培地充てんペトリ皿にいくつかの大人のワームを動かすことによって各プレート上の大人の線虫の開始人口を準備します。インキュベーターで 20 ° C で線虫の文化を維持します 。 注: 線虫の系統は、線虫 ゲノム センターから入手できます。この研究、野生型、N2、ひずみ、OH7547 に (otls199 [猫 2::GFP + rgel-1 (F25B3.3):: した dsRed ローラー表現型を展示、rol-6(su1006)]) 株を利用した +。 将来の文化の伝達のワーム。 線虫 と未使用の生息地低温インキュベーターからペトリ皿を含む 削除ペトリ料理。解剖顕微鏡のステージの上に置きます。 はブンゼン バーナーの光し、赤く点灯するまで炎に金属を配置することによってプラチナの線虫のピックを消毒します。部屋の温度に冷却するための選択を許可します。ピックを設定または汚染物質と接触ピックを聞かせしないでください。 は、細菌の円の端にピックの先端をそっと触れます。この物質は粘着性と個々 の大人線虫を簡単にピッキングを行います。 線虫の成長媒体 (NGM) 寒天培地充てんペトリ プレートに最大 4 妊娠線虫を転送し、20 ° c. で孵化させなさいワームは 4 日間では、成熟卵が産むされます。 4 つの大人の線虫を移動した後、インキュベーターに残りの線虫を戻ります。 2。光セットアップ ( 図 1) セキュア ヘリウム ネオン レーザー光のワークベンチの後ろの左隅付近、電源ソースに接続します 。 注: レーザー ' s 梁がオーバー サンプリングのための要件を満たす必要があります。線虫 は長さ約 1 mm、回折パターンが見つけにくいようににレーザー光線で、線虫のインシデントが 5 mm を超える 2 mm より大きい直径したがって必要があります。 レーザー ビームはサンプルを到達する前にフィルターを通過するようにヘリウム ネオン レーザーとサンプル間の中性密度フィルターを配置します。 使用 2 つのフロント アルミ ステアリング ミラーは、中性密度フィルター後最初のミラーを確保することで潜望鏡をビルドします。2 番目のミラーにレーザービームを操縦し、ミラー間キュベットを挿入する余地を与える最初のミラーの下約 10 cm を確保します。レーザービームがキュヴェットを垂直方向に通過されるようレーザー光とキュベット整列します 。 注: 回折の有機体からフォト ダイオードまでの距離は、遠視野の回折を達成するためにそれ自身の有機物よりもはるかに大きい必要があります。この実験では、キュベットからフォト ダイオードまでの距離は 20 cm。 ミラーに直面してそのセンサーと 2 番目のミラーの真向かいフォト ダイオードをセキュリティで保護します 。 注: 線虫を含むキュベットは、化学のクランプを使用して 2 つのミラー間配置されます。セクション 4 と 5 を参照してください。 は、スタンドに水で満たされたキュベットを配置します。スタンドの高さを調整します。レーザー光フォト ダイオードで直接ではなく、近くを目指したキュベットを通過できるように、高さとミラー 1 ・ ミラー 2 の角度を調整します。 は、スタンド フォーム キュヴェットの水平面を確保するため、レベルを使用します。必要に応じて、さらにミラーを調整します。 は、デジタル ・ オシロ スコープに付属 USB ケーブルを使用してデジタル ・ オシロ スコープにフォト ダイオードを接続します。デジタル ・ オシロ スコープを記録し、データを保存するために使用、コンピューターに接続します。 3。オシロ スコープのセットアップ コンピューターで、オシロ スコープのソフトウェアを使用してワームのスラッシング サイクルを十分に解決する少なくとも 8 Hz にサンプル レートを設定します 。 注: サンプル レートされるべき 2 倍以上種の予想されるスラッシング周波数ナイキスト定理 11 が満たされるようにします。 4。データ収集のワームとキュベットを準備 4 アダルト線虫プレートに転送、新鮮な NGM 10 寒天培地充てんペトリ薄い、平らにされたプラチナ ワイヤー ピック (セクション 1.3 を参照) を使用しています。 だけその畝の両側のキュベットに触れるように注意しながら、パッケージから 1 つの使い捨てプラスチック キュベットを削除します。 マイクロ ピペット ピペット キュヴェットが約 80% になるまでのキュヴェットに蒸留水に満ちて使用蒸留水します 。 注:、蒸留水または M9 10 などリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) イオン バッファーのみに重要な線虫を処理するとき水道水には、微生物を殺す成分が含まれています。 切り裂くスコープ下に c. の elegans を含むペトリ皿を配置します。 プラチナのピックを使用すると、シャーレから 1 つの成熟した 線虫 を削除し、線虫を取り除く必要がある場合、円でピックを移動、キュヴェットにピックを水没します。 泡、キュヴェットの形成を防ぐために 水でキュヴェットを入力は、それは少しキュヴェットの膨らみまで ' s トップ。キュベットを埋める ' 水、完全 s キャップはすぐにキュヴェットにキャップを置く。 以上、光の任意の小さい残りの水滴をきれいにする紙を洗浄こぼした場合があります水滴を除去する光洗浄布を使用します。 5。回折パターン変化のリアルタイム データ集録 オンにヘリウム ネオン レーザーし、赤ビームを生成する周波数/色の設定を調整します。センサーを有効にします 。 注意:632 で低エネルギービームを使用して nm、線虫 を避ける高周波 (青) の光 12。 は、キュベットでワームを探します。マツ材線虫病は約キュヴェットの部分の中心部まで優しくキュヴェットを傾けるその畝の両側のキュベットを保持します 。 注: 振動またはキュベットを激しく傾斜キュヴェットの壁と衝突するワームが発生します。これは線虫を損傷することができます。 レーザー内でワームを中心とした光学系でスタンドにキュベットの場所 ' s ビーム反射ミラー 1 ミラー 2。迷光を排除してください。 レーザ光線でワームを中心します。 フォト ダイオードの位置と回折パターンの中心部最大一致しないように回折パターンのフォト ダイオードを配置します。 は、フォト ダイオードの飽和を防ぐために中性密度フィルターを調整します。光の強度を調節する中立的な密度のフィルター ホイールを回転させます。 中性密度フィルター、フォト ダイオードからの出力電圧が増加するよう回転します 。 注: デジタル フォト ダイオード用ソフトウェアを使用して、出力電圧が観察されます。フォト ダイオードは電圧が変化しない場合に飽和状態します。その場合は、平坦で最小の読書でせずに電圧が減少するまで中立的な密度のフィルターを回転します。電圧信号はフォト ダイオードの飽和を示すピークの測定値でない平らにすることを確認します。飽和が発生した場合、中立的な密度のフィルター ホイールを回転させることにより光の強度を減らす。 移動回折パターンは、ワームを監視しながら、オシロ スコープを制御するソフトウェアのスタート ボタンをクリックすると、フォト ダイオードを用いた表示、収集データ一度 ' s の動き。ワームがレーザー光線と、能の外に移動するまで測定を続けるションのパターンが消えて、通常かかる約 20 秒。 オシロ スコープ用ソフトウェアの停止ボタンをクリックして データ収集停止プロセス。各試行を保存 ' s データを .csv または .txt 形式。 各々 の表現型の少なくとも 50 のデータ セットが収集されてまで手順 5.2 5.3 を繰り返します。トライアルあたり 8 から 10 の動物を使用します。 キュヴェットは場合傷処分とワーム、および手順 4 を繰り返します。ワームが転送である場合、それを処分、繰り返し手順 4 同じキュベットを使用して前に蒸留水でキュヴェットをすすいでください。 手順を繰り返します 5、OH7547 を使用して " ローラー " ワームひずみを示すデータをラベルに注意しながらひずみ。 6。データのフーリエ スペクトル 離散フーリエ変換 3 を行うことができるデータ解析プログラムに取得したデータをインポートします。 ソフトウェアの高速フーリエ変換 (FFT) オプションを使用して各データ セット上の実行フーリエ変換します。 N2 野生型の各振幅のワームの FFT の結果から周波数を平均します。 手順を繰り返します、OH7547 から Fft を使用して 6.3 " ローラー " ワーム。 7。フーリエ スペクトルのモデリング プログラム バイナリ モデル線虫の歩行 (補足資料に含まれているプログラムを参照してください). 注: このモデルは概算でまずワームの動きの顕著な特徴を表示します。モデルは、成果が実際のワームと比較して洗練されたことができます。ワームの形状は、顕微鏡画像 13 を使用して近似です。 バイナリ モデルの少なくとも 2 つのワーム サイクル ( 図 2 a) 移動の連続したフレームを作成します。補足資料のビデオを見るC ワーム ビデオ (CWorm.avi) および W ワーム ビデオ (WWorm.avi) です。 逐次回折パターンを作り出します。補足資料にビデオを参照してください。C ワーム回折ビデオ (CWormDiff.avi) および W ワーム ビデオ (WWormDiff.avi)。 フーリエ変換各ワームのイメージのバイナリ フレームです。なるほどのパディングのワームを囲むフレームより回折像の解像度になります 。 注: 各フーリエ変換されたフレームの絶対値は対応する回折パターン ( 図 2 b) に比例します。 は、回折パターンの強度を対数目盛にマッピングして回折像のコントラストを調整します 。 注: カメラと目の非線形スケールで機能する傾向があります。対数スケールは、どのように回折パターンは通常人間の目によって感知されるシミュレートできます。 モデル化された回折信号を抽出します。 回折パターンでフォト ダイオードの位置に対応する中心から外れた場所を選択します。 は、フォト ダイオードのサイズをシミュレートするフォト ダイオードの位置を囲む隣接行列の要素を追加します。フォト ダイオードのサイズは通常モデルの回折パターンの 0.1% です。 レコードとプロット回折の大きさの順序を示します。信号が物理的に合理的であることを確認してください (すなわち、定期的なスラッシングの場合、フォト ダイオードからの信号べき周期同様). フーリエ 7.3 で得られた回折信号を変換し、実験データと結果を比較します。 系統のワームの繰り返しを比較しています。